國際FAPAS乳粉中金黃色葡萄球菌定量檢測

能力驗證結果與分析

秦 婧1，王琳帆2，魏思宇2，陳奕杉2，陳鴻劍1，鄭玉紅1

（1.陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監督檢驗研究院，陜西西安 710048；2.富平縣檢驗檢測中心，陜西富平 711700）
作者簡(jiǎn)介：秦婧（1989—），女，陜西西安人，碩士，工程師。研究方向：食品微生物檢測。

摘 要：目的：國際FAPAS能力驗證旨在評估實(shí)驗室對于金黃色葡萄球菌的檢測能力，加強實(shí)驗室質(zhì)量管理。方法：依據FAPAS作業(yè)指導書(shū)及GB 4789.10—2016第二法（平板計數法）對乳粉中金黃色葡萄球菌進(jìn)行定量檢測，并用兩種國產(chǎn)配套試劑進(jìn)行比對。結果：采用北京陸橋配套試劑檢測樣品的菌落總數上報結果為1.0×105 CFU/g，且兩種國產(chǎn)配套試劑檢測結果均在能力驗證結果范圍內。結論：國際FAPAS乳粉中金黃色葡萄球菌定量檢測能力驗證結果評價(jià)為滿(mǎn)意，Z值為0，上報結果是此次能力驗證的指定值。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌；能力驗證；定量檢測；FAPAS

能力驗證是利用實(shí)驗室間比對，按照預先制定的準則評價(jià)參加者的能力的外部質(zhì)量活動(dòng)，尋求并參加能力驗證是合格評定機構的責任和義務(wù)[1]。英國FAPAS分析實(shí)驗室能力驗證（Food Analysis Performance Assessment Scheme）是專(zhuān)門(mén)從事食品檢測分析方面的能力評估體系，通過(guò)實(shí)驗室間測試結果的比對來(lái)判定實(shí)驗室能力的合格評定活動(dòng)。FAPAS為世界約3 000家實(shí)驗室專(zhuān)門(mén)提供醫學(xué)、食品檢測方面的能力驗證活動(dòng)；FAPAS建立了一套完整的能力驗證提供者的評價(jià)體系。該體系在全世界各國的食品分析實(shí)驗室迅速普及，它已是食品分析領(lǐng)域全球第一的國際評價(jià)體系[2]。FAPAS在2007年已與CNAS（中國合格評定國家認可委員會(huì )）達成互認。為提高檢驗檢測能力和水平，本實(shí)驗室參加FAPAS于2021年4月的乳粉中金黃色葡萄球菌定量檢測能力驗證，希望通過(guò)此次FAPAS能力驗證來(lái)評估實(shí)驗室檢驗人員的能力，維持實(shí)驗室檢驗檢測水平。依據的方法是GB 4789.10—2016第二法（平板計數法），并對北京陸橋、廣州環(huán)凱兩個(gè)廠(chǎng)家生產(chǎn)的檢測配套培養基進(jìn)行了比對。

1 材料與方法

1.1 試劑

氯化鈉（分析純）來(lái)自天津天力化學(xué)試劑有限公司；Baird-Parker瓊脂平板、血瓊脂平板、胰蛋白胨大豆瓊脂平板（tryptic soy agar,TSA）、革蘭氏染色液、腦心浸出液肉湯（brain heart infusion broth,BHI）和凍干血漿，均分別來(lái)自北京陸橋技術(shù)股份有限責任公司和廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器設備

均質(zhì)器（寧波新芝生物科股份有限公司 SCIENTZ-11）；生化培養箱（上海悅豐儀器儀表有限公司SPX-150B-Ⅱ）；生物顯微鏡（奧林巴斯廣州工業(yè)有限公司 CX23）；可調式混勻儀（大龍興創(chuàng )實(shí)驗儀器北京股份有限公司 MX-S）；生物安全柜（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫療設備廠(chǎng) BSC-1300ⅡA2）。

1.3 方法

1.3.1 能力驗證樣品的接收和確認

實(shí)驗室收到FAPAS乳粉中金黃色葡萄球菌能力驗證樣品1份，樣品編碼是M263E14,樣品為10 g乳粉，塑料瓶包裝，并確認樣品完整性。

1.3.2 能力驗證樣品的前處理和水化

根據FAPAS乳粉中金黃色葡萄球菌（M263E14）能力驗證作業(yè)指導書(shū)的說(shuō)明，開(kāi)啟樣品前應先將樣品放置在室溫下30 min。在二級生物安全柜中以無(wú)菌操作開(kāi)啟樣品，將樣品置于提前準備好的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用少量無(wú)菌生理鹽水充分沖洗樣品容器并將其吸入到放有樣品的均質(zhì)袋中，最終使水化的生理鹽水總量為90 mL，用均質(zhì)器充分混勻，即為10-1樣品勻液。后續依據《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》（GB 4789.10—2016）第二法（平板計數法）進(jìn)行檢測分析。

1.3.3 樣品的稀釋

該步驟在生物安全柜中以無(wú)菌操作進(jìn)行。用1 mL無(wú)菌吸管吸取10-1樣品勻液1 mL,沿管壁緩慢注于盛有9 mL生理鹽水的無(wú)菌試管中（注意吸管尖端不要觸及稀釋液面）,充分振搖試管，制成10-2的樣品勻液。按以上操作程序,依次制備10-3、10-4樣品勻液。后續操作分別使用北京陸橋和廣州環(huán)凱生產(chǎn)的配套試劑進(jìn)行檢測分析。

1.3.4 樣品的接種和培養

在3個(gè)B-P平板上分別加入0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL樣液進(jìn)行涂布。由于GB 4789.10—2016第二法（平板計數法）存在涂布不均勻和B-P平板接種量較大不易吸收的情況，故同時(shí)在5個(gè)B-P平板上各加入0.2 mL樣液進(jìn)行涂布。注意B-P平板應提前一天配制并放于冰箱冷藏，因為新鮮配制的B-P平板表面易有水珠。涂布后,將平板靜置10 min，如樣液不易吸收，可將平板放在培養箱（36±1） ℃培養1 h，等樣品勻液吸收后翻轉平板,倒置放于（36±1） ℃培養24～48 h。

2 結果與分析

2.1 菌落計數及鑒定

樣品培養48 h后，北京陸橋和廣州環(huán)凱的B-P平板上均僅有一種菌落，且菌落呈黑色、有光澤、表面光滑、凸起、濕潤、有淺色的邊緣,周?chē)@以不透明圈,其外有一清晰帶，依據GB 4789.10—2016第二法確定其為典型菌落。將10-3稀釋度的菌落依據GB 4789.10—2016進(jìn)行血平板劃線(xiàn)、染色鏡檢、血漿凝固酶試驗。結果如表1、表2所示。

 

2.2 討論

3個(gè)B-P平板上分別加入接種量為0.3 mL、0.3 mL、

0.4 mL的樣液，采用北京陸橋配套試劑檢測樣品的菌落總數結果為1.0×105 CFU/g，采用廣州環(huán)凱配套試劑檢測樣品的菌落總數結果為9.3×104 CFU/g；5個(gè)B-P平板上各加入接種量為0.2 mL的樣液，采用北京陸橋配套試劑檢測樣品的菌落總數結果為1.1×105 CFU/g，采用廣州環(huán)凱配套試劑檢測樣品的菌落總數結果為9.8×104 CFU/g。樣液接種量為0.2 mL的方法，采用北京陸橋和廣州環(huán)凱試劑的樣品菌落總數檢測結果均要大于樣液接種量分別為0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL的方法，因為GB 4789.10—2016第二法（平板計數法）本身存在接種量較大和涂布不均勻的情況，沒(méi)有接種量為0.2 mL的方法有利于菌落生長(cháng)，這一點(diǎn)與已有陸其聰等人[3]與王洪亮等人[4]的相關(guān)研究一致。因為本次FAPAS能力驗證采用方法為

GB 4789.10—2016第二法（平板計數法），日常樣品檢測采用北京陸橋配套試劑，故上報結果為1.0×105 CFU/g。此次國際FAPAS乳粉中金黃色葡萄球菌定量檢測能力驗證結果評價(jià)為滿(mǎn)意，且Z值為0，說(shuō)明上報結果是為此次能力驗證指定值，由此可見(jiàn)該實(shí)驗室具備金黃色葡萄球菌定量檢測分析能力。

3 注意事項

對于新取得檢驗檢測資質(zhì)的微生物實(shí)驗室來(lái)說(shuō)，承接能力驗證前需要進(jìn)行大量的準備工作，現就準備工作做一個(gè)總結，以期為新實(shí)驗室或新進(jìn)檢測人員提供參考。

①準備工作。得知要參加能力驗證后應提前準備相關(guān)試劑、器具和設備，如提前驗證商品化培養基，提前準備所用三角瓶和試管，且不與日常檢測相混淆，提前確定使用的培養箱是否潔凈、是否在計量有效期內等。②作業(yè)指導書(shū)。收到樣品后，應首先確認樣品的完整性并記錄收樣日期，不要急于準備相關(guān)試劑，應先制定作業(yè)指導書(shū)和確定檢驗依據。③試劑配制。新鮮配制的B-P平板較軟、不好涂布，應提前1 d配制并在第2 d使用；使用前確認B-P平板干燥、無(wú)水珠，若有水珠可提前放置在培養箱中待水珠消失；9 mL生理鹽水應在使用時(shí)分裝，不可分裝好后再滅菌，因為滅菌過(guò)程中會(huì )使9 mL生理鹽水增加或減少，影響結果準確性。④試驗操作。樣品應提前從冰箱中取出并恢復至室溫，可安排兩人同步試驗，一人取樣并進(jìn)行10-1倍稀釋?zhuān)♂尯煤?，兩人分別進(jìn)行后續稀釋和加樣，進(jìn)行人員比對；涂布時(shí)每個(gè)稀釋梯度使用一根涂布棒，不可每個(gè)B-P平板用一根涂布棒，會(huì )造成樣液損失，影響結果準確性；注意整個(gè)操作應在

20 min內完成，因為細菌20～30 min繁殖一代[5]；完成試驗后，若B-P平板上樣液不吸收，可將平板放在培養箱（36±1） ℃培養1 h，等樣品勻液吸收后翻轉平板,倒置培養。⑤計數。按照檢驗依據所描述的菌落形態(tài)進(jìn)行典型和可疑菌落計數，并一定拍照保存，平板前后均要拍照，平板背面更方便觀(guān)察典型菌落透明圈，便于識別典型菌落，照片可作為科室學(xué)習資料保存。

參考文獻

[1]中國合格評定國家認可委員會(huì ).能力驗證規則:CNAS-RL02:2016[EB/OL].(2016-04-15)[2021-05-21].https://www.docin.com/p-1699040362.html.

[2]陳萬(wàn)勝,馬莉,亓瀟.國際FAPAS乳粉中沙門(mén)菌屬能力驗證的關(guān)鍵點(diǎn)[J].河南預防醫學(xué)雜志,2020,31(12):900-903.

[3]陸其聰,鐘宇思,王立博,等.金黃色葡萄球菌定量檢測能力驗證結果與分析[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2017,38(16):153-156.

[4]王洪亮,程艷宇,王夢(mèng)曉.食品中金黃色葡萄球菌定量檢測方法的研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2016,37(9):185-187.

[5]雷蘭蘭.食品微生物能力驗證的重要因素[J].現代食品,2018(16):4-6.