家庭自制酵素中的微生物污染檢測

何 曼1,2，李 松1,2，仇 雨1,2，周 璇1,2，陳麗麗2*

摘 要：目的：了解家庭自制酵素的微生物污染狀況，為酵素的安全食用提供參考數據。方法：收集6個(gè)家庭中蘋(píng)果、火龍果和香蕉酵素，每種2個(gè)樣品，共6個(gè)樣品，按照中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì )食用植物酵素團體標準（T/CBFIA 08003—2017），發(fā)酵完成后在貯存0 d、5 d、10 d、15 d、20 d時(shí)取樣，對其感官性狀、菌落總數、大腸菌群、霉菌和酵母數量進(jìn)行測定。結果：6個(gè)檢樣感官性狀和大腸菌群數均符合標準。樣品菌落總數均大于102 CFU/mL，且菌落總數隨著(zhù)保存時(shí)間的延長(cháng)有增長(cháng)趨勢；蘋(píng)果和火龍果酵素的霉菌總數均大于20 CFU/mL，香蕉酵素的霉菌總數合格；所有檢樣的酵母菌數量較高，均超過(guò)104 CFU/mL，且呈現先增多后減少的趨勢。結論：自制酵素菌落總數、霉菌總數和酵母菌總數均有超標情況，存在一定的健康風(fēng)險。

關(guān)鍵詞：自制酵素；菌落總數；大腸菌群數；霉菌；酵母菌

酵素產(chǎn)品主要盛行于日本、美國、一些歐洲國家及東南亞地區，且形成了品牌產(chǎn)業(yè)規模。近十多年來(lái)，在中國開(kāi)始盛行，越來(lái)越多的酵素理念被引入到農業(yè)、食品、美容保健等領(lǐng)域[1-2]。酵素是用果蔬、菌菇或中草藥等作為原材料，通過(guò)發(fā)酵，形成富含礦物質(zhì)、氨基酸、多種酶、乳酸、醋酸和少量乙醇等代謝產(chǎn)物的液態(tài)和固態(tài)食品[3-4]。

酵素富含大量脂肪酶、淀粉酶、超氧化物歧化酶、乳酸、醋酸、少量乙醇等代謝產(chǎn)物、酚類(lèi)和黃酮類(lèi)等生物活性成分，植物酵素中還有大量的抗氧化成分和多種營(yíng)養物質(zhì)[5-6]。不同原料酵素具有的功能不相同，如桑葚酵素可以補益腎肝、延緩衰老[7-8]；獼猴桃酵素能夠安神益智、美容養顏[9]；黑加侖酵素能夠預防高血壓，心臟病，具有較強的抗氧化能力[10-11]。

酵素因為其眾多的功效而受到很多人的青睞，近年來(lái)，家庭自制酵素越來(lái)越流行。但自制酵素由于沒(méi)有對其生產(chǎn)條件進(jìn)行嚴格地控制，在生產(chǎn)和貯存過(guò)程中容易受到微生物污染，微生物的污染程度與貯存的時(shí)間密切相關(guān)。被污染的酵素其食用價(jià)值和功效價(jià)值將會(huì )受到影響，也會(huì )對人體的健康造成危害。為評價(jià)家庭自制酵素的衛生微生物指標合格情況，本項目收集了6家3種不同原材料的酵素，檢測不同貯存時(shí)間后的感官性狀、pH值、菌落總數、大腸菌群數、霉菌和酵母數。

1 材料與方法

1.1 材料

普通營(yíng)養瓊脂和馬鈴薯葡萄糖瓊脂購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯和煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

實(shí)驗所用酵素為6個(gè)家庭的自制酵素，包括蘋(píng)果、香蕉、紅心火龍果酵素，制備過(guò)程均為將各種原材料洗凈瀝干，切碎（＜0.5 cm3），加入酵素桶中，用無(wú)菌水溶解白砂糖后加入，攪拌均勻后，密封發(fā)酵7 d而成。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 培養基的配制

營(yíng)養瓊脂培養基、馬鈴薯葡萄糖培養基、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯、煌綠乳糖膽鹽肉湯，按試劑說(shuō)明書(shū)配制，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，分裝后備用。

1.2.2 pH測定

取少量樣品用酸度計（sartorius PB-10）進(jìn)行測定。

1.2.3 樣品稀釋處理

用1 mol/L的NaOH溶液調節樣品pH值，使其在6.5～7.5，以無(wú)菌操作，分別取貯存0 d、5 d、10 d、15 d、20 d的各種酵素25 mL于裝有225 mL滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶?jì)?，充分振蕩，制?︰10的均勻稀釋液。用滅菌吸管吸取1︰10稀釋液1 mL，加入含有9 mL滅菌生理鹽水的試管內，振蕩試管，混合均勻，做成1︰100的稀釋液。另取1 mL滅菌吸管，按上述操作，制成10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1 mL滅菌吸管。

1.2.4 菌落總數測定

按照《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數測定》（GB 4789.2—2016），測定樣品中菌落總數[12]。根據食品衛生標準要求對標本污染情況的估計，選擇2～3個(gè)適宜稀釋度，取1 mL稀釋液于滅菌平皿內，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。加入約15 mL，46 ℃左右的營(yíng)養瓊脂培養，轉動(dòng)平皿使混合均勻。同時(shí)將營(yíng)養瓊脂培養基傾入加有1 mL稀釋液的滅菌平皿內作空白對照。待瓊脂凝固后，翻轉平板，在（36±1）℃溫箱內培養（48±2）h。

1.2.5 大腸菌群檢測

按照《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數》（GB 4789.3—2016）的MPN法，測定樣品中大腸菌群數[13]。

（1）初發(fā)酵實(shí)驗。每個(gè)樣品選擇3個(gè)適合的連續稀釋度的樣品勻液，每個(gè)稀釋度接種3管LST肉湯，每管接種

1 mL，（36±1） ℃培養（24±2） h，觀(guān)察管內是否產(chǎn)生氣泡，（24±2） h產(chǎn)氣者進(jìn)行復發(fā)酵實(shí)驗，如未產(chǎn)氣則繼續培養至（48±2）h，產(chǎn)氣者進(jìn)行復發(fā)酵實(shí)驗，未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。

（2）復發(fā)酵實(shí)驗（證實(shí)實(shí)驗）。用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管分別取培養物1環(huán)，移種于BGLB肉湯中（36±1）℃培養（48±2） h，觀(guān)察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計為大腸菌群陽(yáng)性管。

根據確證的大腸菌群BGLB陽(yáng)性管數，檢索大腸菌群MPN表，報告每mL樣品中大腸菌群的MPN值。

1.2.6 霉菌和酵母菌計數

按照《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數》（GB4789.15—2016），測定樣品中霉菌和酵母菌數[14]。根據食品衛生標準要求或對標本污染情況的估計，選擇2～3個(gè)適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度取1 mL稀釋液于滅菌平皿內，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。加入46 ℃馬鈴薯葡萄糖培養基，并轉動(dòng)平皿使混合均勻。同時(shí)將馬鈴薯葡萄糖培養基傾入加有1 mL稀釋液的滅菌平皿內作空白對照。待瓊脂凝固后，翻轉平板，在（28±1）℃溫箱內培養5 d。

2 結果與分析

2.1 感官指標

本次實(shí)驗共檢測蘋(píng)果、火龍果和香蕉酵素，每種2個(gè)樣品，共6個(gè)樣品。其中蘋(píng)果和香蕉酵素均呈乳白色，火龍果酵素呈紫紅色，具有該水果特有的芳香性氣味，pH均小于4，無(wú)肉眼可見(jiàn)的外來(lái)雜質(zhì)。

2.2 菌落總數

由表1可知，本實(shí)驗檢測的3種自制酵素中菌落總數含量均達104 CFU/mL以上，且隨著(zhù)保存時(shí)間的延長(cháng)，菌落總數呈現先增加后減少再增加的趨勢如圖1所示。

 

此外，不同原料的自制酵素菌落總數達到最大值的時(shí)間不同，蘋(píng)果酵素在第10 d時(shí)的菌落總數達到最大值，火龍果和香蕉在第5 d達到最大值。

2.3 大腸菌群數

按照《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數》（GB 4789.3—2016）的MPN法，測定了樣品中大腸菌群數，發(fā)現樣品中的大腸菌群數均小于3，見(jiàn)表2。

2.4 霉菌數

由表3可知，蘋(píng)果酵素和火龍果酵素的霉菌數量均大于20 CFU/mL，最大為350 CFU/mL；香蕉酵素的霉菌數量小于20 CFU/mL；隨保存時(shí)間的延長(cháng)，霉菌數量無(wú)明顯變化規律。

 

2.5 酵母菌數

按照《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數》（GB 4789.15—2016），測定樣品中的酵母菌數。由表4可知，每種自制酵素樣品中酵母菌的含量均較高，均超過(guò)

 

3 結論與討論

（1）本實(shí)驗共收集了6個(gè)家庭自制的3種酵素樣品，先觀(guān)察其感官性狀，并檢測其pH值，發(fā)現蘋(píng)果和香蕉酵素均呈乳白色，火龍果酵素呈紫紅色，具有該水果特有的芳香性氣味，pH均＜4，無(wú)肉眼可見(jiàn)的外來(lái)雜質(zhì)。與中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì )食用植物酵素團體標準食物酵素[15]中關(guān)于感官性狀的要求：自制酵素應具有產(chǎn)品應有的色澤，滋味且無(wú)肉眼可見(jiàn)的雜質(zhì)，pH＜4相吻合。

（2）菌落總數為衛生微生物指示性指標之一，用來(lái)判定食品樣品被微生物污染的程度及衛生質(zhì)量。菌落總數一定程度上能夠反映食品的新鮮程度、是否變質(zhì)以及生產(chǎn)過(guò)程的衛生狀況等，人體長(cháng)期食用菌落總數超標的食物，可能會(huì )引起胃腸道疾病。本實(shí)驗檢測的6個(gè)酵素樣品菌落總數均在

104 CFU/mL以上，且隨著(zhù)保存時(shí)間的延長(cháng)，菌落總數呈先減少后增加的趨勢。T/CBFIA 08003—2017食物酵素[16]要求：酵素中菌落總數小于102 CFU/mL，檢測的自制酵素樣品的菌落總數均超標。酵素在制備的過(guò)程中，隨著(zhù)發(fā)酵時(shí)間的延長(cháng)，pH值逐漸下降，酵素產(chǎn)品的pH均＜4，然后在貯存過(guò)程中，由于微生物的繁殖，pH值逐漸增高，而細菌最合適的pH條件為7.2左右，導致隨著(zhù)保存時(shí)間的延長(cháng)菌落總數先減少后增加。

（3）大腸菌群主要來(lái)源于人和溫血動(dòng)物糞便，可以指示腸道傳染病傳播的可能性。本實(shí)驗6個(gè)樣品中的大腸菌群數均＜3，說(shuō)明制作過(guò)程中不存在糞便污染，腸道疾病傳播的可能性較小。

（4）霉菌和酵母菌是發(fā)酵食品中常見(jiàn)的微生物，少量的霉菌和酵母不會(huì )造成食品質(zhì)量安全事故。但是霉菌過(guò)度生長(cháng)會(huì )造成食品霉變，酵母菌污染會(huì )導致產(chǎn)品脹包、腐敗及風(fēng)味的改變，給食品質(zhì)量和安全帶來(lái)影響。酵母菌和霉菌過(guò)度繁殖會(huì )影響食品的風(fēng)味，許多霉菌的代謝產(chǎn)物具有很強的毒性，甚至致癌。T/CBFIA 08003—2017食物酵素的標準[15]要求霉菌的數量小于20 CFU/mL，本實(shí)驗中香蕉酵素霉菌總數均小于20 CFU/mL，而蘋(píng)果和火龍果酵素中霉菌數量均大于20 CFU/mL，最大達350 CFU/mL，這可能與水果的水分和含糖量有關(guān)，一般含糖高、水分高的食物更利于霉菌的生長(cháng)。酵素中的酵母菌含量較高，呈現隨保存時(shí)間延長(cháng)先增加后減少。酵母菌前期數量的增加可能是因為在發(fā)酵過(guò)程中添加了大量的白砂糖，酵母菌可以利用糖類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行生長(cháng)和繁殖，然后糖類(lèi)的量減少，醇類(lèi)和酸類(lèi)物質(zhì)增多，酵母菌的生長(cháng)受到抑制，導致其數量減少[16]。

目前，食品安全已經(jīng)成為了廣泛關(guān)注的問(wèn)題，而微生物污染是影響食品安全最重要的因素。食品中微生物污染情況的檢測是防止微生物污染食品流入市場(chǎng)、保障人們身體健康的關(guān)鍵措施。因此，加強食品微生物污染檢測至關(guān)重要。

通過(guò)對家庭自制酵素的主要衛生微生物指標的測定，發(fā)現自制酵素產(chǎn)品的菌落總數、霉菌和酵母總數均超標，提示食用自制酵素有一定的健康風(fēng)險。自制酵素的制作應嚴格把控酵素的生產(chǎn)、貯存條件，盡量通過(guò)正規渠道購買(mǎi)合格、安全的產(chǎn)品，使酵素以最低的安全風(fēng)險發(fā)揮其最大的食用價(jià)值。

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