QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞蛋中的氯霉素類(lèi)獸藥殘留

何 江

（貴陽(yáng)市農產(chǎn)品質(zhì)量安全監督檢驗測試中心，貴州貴陽(yáng) 550081）

摘 要：目的：建立了QuEChERS方法結合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定雞蛋中氯霉素類(lèi)獸藥殘留分析方法。方法：雞蛋樣品以80%乙腈水提取，加入鹽析劑處理，取上清液經(jīng)C18凈化，UPLC-MS/MS測定。結果：目標化合物在0.010～0.100 µg/mL濃度范圍內線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數R≥0.991，檢出限和定量限分別為0.505～0.750 µg/kg和1.683～2.500 µg/kg。在0.01 mg/kg添加水平下，氟苯尼考胺、氯霉素、氟甲砜霉素的平均加標回收率范圍在76.5%～108.0%，相對標準偏差（RSD）范圍在5.33%～6.01%。結論：本方法快速、簡(jiǎn)便、準確，可用于雞蛋中氯霉素類(lèi)藥物的殘留測定。

關(guān)鍵詞：QuEChERS；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；雞蛋；氯霉素

 

雞蛋營(yíng)養豐富，富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等，是餐桌上常見(jiàn)的食品。氯霉素類(lèi)抗生素具有廣譜性，能有效治療動(dòng)物疾病。但是，氯霉素存在嚴重的毒副作用，如能抑制人體骨髓造血功能，引起人體的再生障礙性貧血，粒狀白細胞缺乏癥[1]。由于氯霉素類(lèi)藥物價(jià)格低廉，療效好，在畜禽養殖過(guò)程中會(huì )殘留在雞蛋中，對人們的健康和環(huán)境構成嚴重危害，我國已經(jīng)明確規定氯霉素不得在雞蛋中檢出[2]。

QuEChERS前處理方法具有快速、簡(jiǎn)便、廉價(jià)、有效、耐用、安全等特點(diǎn)，是近年來(lái)應用廣泛的樣品前處理技術(shù)，常常用于獸藥殘留分析。氯霉素類(lèi)藥物的測定方法主要有氣相色譜法[3]、氣相色譜-質(zhì)譜法[4]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5]等，其中超高效串聯(lián)質(zhì)譜法具有分析速度快和靈敏度高的特點(diǎn)。本研究在QuECHERS方法的基礎上，對提取溶液種類(lèi)和凈化劑含量等參數進(jìn)行了優(yōu)化，結合UPLC-MS/MS測定，建立了一種快速、有效、簡(jiǎn)便的測定雞蛋中氯霉素類(lèi)藥物的方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：MixOne數顯渦旋振蕩器（合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司）；高速離心機（日本Hitachi Limited公司）；FSH-2可調高速電動(dòng)勻漿機（上海天由儀器科技有限公司）；Milli-Q超純水凈儀（美國Millipore公司）；超聲波清洗器（浙江納德科學(xué)儀器有限公司）；Waters XEVO MS超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司）。

試劑：氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺標準品溶液

（100 µg/mL）（北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司）；乙腈、甲酸和甲醇（HPLC級，美國德國MERCK公司）；實(shí)驗室用水為Milli-Q超純水；十八烷基鍵合硅膠填料（C18）和石墨化炭黑（GCB）（美國Agilent公司）。

1.2　試驗方法

1.2.1 標準溶液配制

分別吸取濃度為100 µg/mL標準溶液（氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺），用甲醇配制成濃度為2.0 µg/mL的混合標準儲備液。準確吸取適量混合標準儲備液，用空白提取液稀釋成濃度為0.01 µg/mL、0.02 µg/mL、0.04 µg/mL、

0.08 µg/mL和0.10 µg/mL的基質(zhì)混合標準溶液，流動(dòng)相（甲醇∶水=10%∶90%）稀釋成濃度梯度為同系列濃度的溶劑混合標準溶液。

1.2.2 樣品前處理

稱(chēng)取雞蛋樣品2.00 g（精確至0.01 g）置于50 mL離心管中，加入10.0 mL乙腈-水（8∶2，V/V）（含0.1%甲酸）提取，高速勻漿，靜置5 min，加入1 g MgSO4和1 g NaCl，劇烈振蕩3 min后，超聲提取10 min，10 000 r/min離心

10 min，取上清液于5 mL離心管中，加入10.0 mg固相萃取填料C18進(jìn)行凈化，10 000 r/min離心10 min，過(guò)0.22 µm濾膜后，UPLC-MS/MS測定。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 µm）；流動(dòng)相：A為0.1%（V/V）甲酸水溶液，B為甲醇。梯度洗脫程序：0～3 min，20% B；3～5 min，80% B；5～

8 min，100% B；8～10 min，10% B。流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：5 µL。

1.2.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離源（ESI）；負離子模式掃描（氟苯尼考胺為正離子模式）；多反應監測（MRM）；電噴霧電壓：3.5 kV，離子源和離子化溶劑溫度分別為150 ℃和500 ℃，離子化和錐孔氣體流量分別為1 000 L/h和50 L/h。質(zhì)譜參數見(jiàn)表1。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

本研究考察了6種提取溶劑的提取效果，分別為90%甲醇水、80%甲醇水、70%甲醇水、90%乙腈水、80%乙腈水和70%乙腈水。結果表明，含有甲醇組的提取液色素干擾嚴重，蛋白沉淀效果差，影響目標物提取，回收率均在60%以下。乙腈組織滲透力和沉淀蛋白質(zhì)能力強，本試驗選取乙腈作為提取溶劑。提取劑中加入水的含量對目標物氟苯尼考胺的提取有顯著(zhù)影響，其中提取劑中含水量為10%和20%時(shí)，氟苯尼考胺回收率無(wú)差異，當提取劑中含水量下降到30%時(shí)，氟苯尼考胺的回收率從90%下降為50%。為了減少有機溶劑乙腈的用量，節約成本，因此，選擇乙腈-水（8∶2，V/V）為提取溶劑，提取回收率在76.5%～108%，按照GB/T 27404—2008準確度要求，該方法滿(mǎn)足農藥殘留檢測的要求。

2.2 凈化劑的選擇

C18可以去除提取液中非極性物質(zhì)，降低干擾和減小基質(zhì)效應，提高分析結果的準確性和重現性；GCB可以消除色素對試驗結果的干擾和質(zhì)譜離子化的影響。本文分別考察了加入5 mg、10 mg、20 mg和30 mg的C18加入量對目標物的影響。研究證明C18為20 mg，添加濃度為0.01 mg/kg時(shí)，氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收率范圍在76.5%～108%。同時(shí)，當在20 mg C18中加入

20 mg GCB時(shí)，氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收范圍為75.6%～92.4%，為了節約成本和減少試驗步驟，本研究選擇不加GCB。因此，本研究選擇凈化劑為C18，添加量為20 mg。

2.3 色譜-質(zhì)譜條件選擇及優(yōu)化

在相同梯度洗脫條件下，考察了流動(dòng)相甲醇-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液對氟苯尼考胺、氯霉素和氟甲砜霉素的分離度、靈敏度和峰型的影響。試驗表明，以乙腈水體系為流動(dòng)相時(shí)，氟苯尼考胺保留時(shí)間小于

0.5 min；以甲醇水體系作為流動(dòng)相時(shí)，氟苯尼考胺能有效保留，保留時(shí)間為1.27 min，本研究選擇洗脫能力弱的甲醇體系，圖1為氯霉素類(lèi)藥物在甲醇體系的MRM色譜圖。

氯霉素類(lèi)藥物用甲醇配制成濃度為200 µg/L，質(zhì)譜注射泵直接進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行MS掃描，優(yōu)化毛細管電壓尋找母離子；優(yōu)化碰撞能量，選擇響應高和干擾小的子離子作為定量離子。電離模式、定量離子對、定性離子對、碰撞能量及錐孔電壓見(jiàn)表1。

 

圖1 氯霉素類(lèi)藥物的MRM色譜圖

2.4 基質(zhì)效應、檢出限和定量限

配制基質(zhì)匹配混合標準溶液，UPLC-MS/MS進(jìn)行檢測。在0.010～0.100 µg/mL范圍內溶劑和基質(zhì)匹配標準曲線(xiàn)的線(xiàn)性相關(guān)系數R≥0.991。以定量離子的信噪比S/N=3和S/N=10分別計算檢出限（LOD）和定量限（LOQ）[6]，氯霉素類(lèi)化合物在雞蛋基質(zhì)中的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別為0.505～0.750 µg/kg和1.683～2.500 µg/kg，結果見(jiàn)

表2。

在UPLC-MS/MS檢測復雜樣品時(shí)，易受樣品基質(zhì)的干擾，影響目標物的離子化，產(chǎn)生增強或抑制效應，稱(chēng)為基質(zhì)效應（Matrix Effect，ME）[7]?；|(zhì)效應=基質(zhì)匹配校準曲線(xiàn)的斜率／溶劑標準校準曲線(xiàn)的斜率，比值越接近1，則基質(zhì)效應越??；比值在0.8～1.2范圍內，則表明基質(zhì)效應不明顯?；|(zhì)效應見(jiàn)表2，除氟苯尼考胺外，氯霉素和氟甲砜霉素在雞蛋中基質(zhì)效應較為明顯，因此采用空白基質(zhì)匹配標準曲線(xiàn)以降低基質(zhì)效應的影響。

2.5 回收率與精密度

選擇空白雞蛋樣品，在0.01 mg/kg添加水平下，進(jìn)行6次平行試驗。采用基質(zhì)匹配標準曲線(xiàn)進(jìn)行定量分析，氯霉素類(lèi)藥物在雞蛋基質(zhì)中的回收率與相對標準偏差結果見(jiàn)表3。氟苯尼考胺、氯霉素、氟甲砜霉素的平均加標回收率范圍在76.5%～108.0%，相對標準偏差（RSD）范圍在5.33%～6.01%，符合《實(shí)驗室質(zhì)量控制規范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）[8]。

2.6 實(shí)際樣品測定

隨機選取超市和養殖場(chǎng)的動(dòng)物源性食品，包括超市雞蛋12份和養殖場(chǎng)21份，共33份樣品，運用所建立的方法對樣品進(jìn)行檢測，同時(shí)做方法對比，運用國標方法《動(dòng)物源性食品中氯霉素類(lèi)藥物殘留量測定》（GB/T 22338—2008）[9]。結果顯示，所測的33份雞蛋樣品均未檢出氟苯尼考胺、氯霉素和氟甲砜霉素。

3 結論

本文利用QuEChERS方法結合超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法，建立了雞蛋樣品基質(zhì)中氯霉素獸藥殘留的測定方法。該方法快速、簡(jiǎn)便、靈敏，能夠對樣品中的目標化合物進(jìn)行準確的定性和定量分析，采用基質(zhì)匹配校正曲線(xiàn)定量，能最大程度地消除基質(zhì)干擾，使檢測結果更加精確，適用于動(dòng)物源性食品雞蛋中獸藥殘留的快速檢測。

參考文獻

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[8]中華人民共和國國家質(zhì)量監督檢驗檢疫總局,中國國家標準化管理委員會(huì ).實(shí)驗室質(zhì)量控制規范 食品理化檢測GB/T 27404—2008[S].北京:中國標準出版社,2008.

[9]國家質(zhì)量監督檢驗檢疫總局.動(dòng)物源性食品中氯霉素類(lèi)藥物殘留量測定GB/T 22338—2008[S].北京:中國標準出版社,2008.