基質(zhì)固相分散-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定雞蛋中氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留

宋 磊

（貴州醫科大學(xué)，公共衛生學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025）

摘 要：目的：建立雞蛋中氟蟲(chóng)腈及代謝物殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。方法：在QuEChERS方法基礎上，對提取溶液、鹽析劑和凈化劑等參數進(jìn)行了優(yōu)化。最終，樣品以乙腈水提取，C18凈化，UPLC-MS/MS測定。結果：氟蟲(chóng)腈及其代謝物在10～100 ng/mL范圍內線(xiàn)性關(guān)系較好，相關(guān)系數r≥0.995，以3倍和10倍信噪比計算氟蟲(chóng)腈及其代謝物的檢出限和定量限分別為0.162～0.685 µg/kg和0.541～2.285 µg/kg。在雞蛋空白樣品添加濃度為0.02 mg/kg水平下，氟蟲(chóng)腈、氟蟲(chóng)腈砜、氟甲腈、氟蟲(chóng)腈硫醚回收率范圍為78.0%～107.4%，相對標準偏差（RSD）為3.93%～5.66%。結論：本方法快速、簡(jiǎn)便、準確，可用于雞蛋中的氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留的測定。

關(guān)鍵詞：基質(zhì)固相分散；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；氟蟲(chóng)腈；雞蛋

 

雞蛋蛋黃中的卵磷脂、甘油三酯、膽固醇和卵黃素對神經(jīng)系統和身體發(fā)育有益，還能改善記憶力，雞蛋中的蛋白質(zhì)能夠修復肝臟組織損傷[1]。在養殖過(guò)程中，獸藥能預防和治療疾病，這些藥物在使用過(guò)程中會(huì )直接或間接地進(jìn)入雞體內，對人體健康產(chǎn)生影響。氟蟲(chóng)腈主要用于防治多種害蟲(chóng)[2]，但是氟蟲(chóng)腈會(huì )對生態(tài)環(huán)境和人體健康造成影響，所以我國規定2009年10月1日起禁用氟蟲(chóng)腈[3]。

QuEChERS法具有快速、簡(jiǎn)便、廉價(jià)、有效、耐用、安全，是近年來(lái)應用日趨廣泛的萃取技術(shù)，已被逐步用于獸藥殘留檢測領(lǐng)域[4-5]。氟蟲(chóng)腈類(lèi)藥物的測定方法主要包括氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。UPLC-MS/MS在獸藥殘留檢測方面具有強的定性和定量分析能力，廣泛應用于農藥和獸藥殘留的檢測[6-8]。本研究通過(guò)試驗探究QuEChERS方法結合UPLC-MS/MS檢測雞蛋中氟蟲(chóng)腈類(lèi)抗菌藥物殘留的試驗條件，建立了一種快速、有效、簡(jiǎn)便的測定雞蛋中氟蟲(chóng)腈類(lèi)藥物的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑：乙腈、甲酸、甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；實(shí)驗室用水為Milli-Q超純水；無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉（徐州淞譽(yù)化工科技有限公司）；C18購買(mǎi)于美國Waters公司；氟蟲(chóng)腈、氟蟲(chóng)腈砜、氟甲腈和氟蟲(chóng)腈硫醚標準品溶液（100 µg/mL）（北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司）。

儀器：Waters TQ MS超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；HC-3515高速離心機（日本日立公司）；Milli-Q超純水凈儀（美國密理博公司）；KQ-500V數控超聲波清洗器；數顯渦旋振蕩器（美國賽默飛公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制

（1）混合標準儲備液。分別吸取標準品溶液氟蟲(chóng)腈、氟蟲(chóng)腈砜、氟甲腈、氟蟲(chóng)腈硫醚1 mL至10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容配成濃度為10 µg/mL的標準儲備液。

（2）混合標準中間液。準確吸取混合標準儲備液，用甲醇定容配成濃度為1.0 µg/mL的混合標準中間液。

（3）溶劑和基質(zhì)標準溶液的配制。準確吸取適量混合標準中間液，濃度為1.0 µg/mL，用流動(dòng)相初始比例逐級稀釋成質(zhì)量濃度為10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL和100 ng/mL的溶劑混合標準溶液，基質(zhì)標準溶液按照相同系列濃度配制。

1.2.2 樣品前處理

稱(chēng)取雞蛋樣品2.00 g置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈/水（9∶1，V/V）（含0.5%甲酸）作為提取溶劑，旋渦振蕩均勻，加入1 g無(wú)水硫酸鎂和1 g氯化鈉，劇烈振蕩3 min，超聲提取10 min，4 ℃條件下，10 000 r/min離心

5 min，吸取上清液加入含有10 mg C18凈化管中，手動(dòng)劇烈振蕩3 min，4 ℃條件下，10 000 r/min離心5 min，0.22 µm濾膜過(guò)濾后，UPLC-MS/MS檢測。

1.2.3 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：Waters ACQUITY UPLC CSH C18（1.7 µm，100 mm×2.1 mm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 µL；流速：0.2 mL/min；流動(dòng)相A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液。梯度洗脫程序：0～6 min，10%～30% A；6～

9 min，30%～50% A；9～9.5 min，50%～100% A；9.5～

12.5 min，100% A；12.5～15 min，100%～10% A。

（2）質(zhì)譜條件。電離方式：電噴霧電離源，負離子模式掃描，多反應監測（MRM）；用MassLynx 4.1軟件進(jìn)行數據分析，毛細管電壓為3.0 kV，去溶劑溫度和離子源溫度分別為400 ℃和150 ℃，碰撞氣體（氬氣）和去溶劑氣體（氮氣）流量分別為0.14 L/min和800 L/h。質(zhì)譜多反應監測（MRM）參數見(jiàn)表1。

2 結果與分析

2.1 色譜和質(zhì)譜條件優(yōu)化

本文考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸溶液共4種流動(dòng)相在相同梯度洗脫條件，對氟甲腈、氟蟲(chóng)腈硫醚、氟蟲(chóng)腈和氟蟲(chóng)腈砜化合物的分離度、靈敏度和峰型的影響。結果表明，4種化合物在不同體系中相應值比較為：甲醇-水＜甲醇-0.1%甲酸溶液＜乙腈-水=乙腈-0.1%甲酸溶液，故選擇含有乙腈體系的流動(dòng)相；試驗對4種化合物在不同體系中的峰形進(jìn)行比較，發(fā)現含有甲酸組的對稱(chēng)性?xún)?yōu)于不含甲酸組的。因此，本研究選擇乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相。

用甲醇分別配制氟甲腈、氟蟲(chóng)腈硫醚、氟蟲(chóng)腈和氟蟲(chóng)腈砜化合物的濃度為200 ng/mL，通過(guò)質(zhì)譜注射泵直接進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行MS掃描，優(yōu)化毛細管電壓和碰撞能量，選擇響應豐度較高、干擾較少的作為定量離子對。質(zhì)譜參數見(jiàn)表1；氟蟲(chóng)腈藥物的MRM色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 氟蟲(chóng)腈藥物色譜圖

2.2 提取溶劑的優(yōu)化

選擇雞蛋為試驗樣品，考察了甲醇/水（9∶1）、乙腈/水（9∶1）、乙腈/水（9∶1）（含0.1%甲酸）、乙腈/水（9∶1）（含0.5%甲酸）和乙腈/水（9∶1）（含1%甲酸）5種提取溶劑對氟甲腈、氟蟲(chóng)腈硫醚、氟蟲(chóng)腈和氟蟲(chóng)腈砜化合物的提取效果。結果表明，含有乙腈組分的提取劑對組織滲透力強，對目標物提取效果好，且沉淀蛋白質(zhì)及脂肪能力強，因此本試驗選取乙腈作為提取溶劑。隨著(zhù)甲酸含量的加入，有利于目標物提取，當加入量超過(guò)0.5%時(shí)，提取效率明顯降低。因此，選擇乙腈/水（9∶1）（含0.5%甲酸）為本試驗的提取溶劑，提取回收率在78%～107.4%。

2.3 鹽析劑的優(yōu)化

加入無(wú)水MgSO4可促使蛋白質(zhì)變性分散，防止樣品形成塊狀影響提取回收，同時(shí)能吸取提取溶劑中的水分，促進(jìn)目標化合物溶解在乙腈層；加入氯化鈉有利于水相和有機相分離，降低目標物在水層中的溶解度，更加有利于藥物的提取。本文考察了9組鹽析劑無(wú)水硫酸鎂和氯化鈉的組合，分別為2 g和3 g、2 g和2 g、2 g和1 g、1 g和3 g、1 g和2 g、1 g和1 g、0.5 g和3 g、0.5 g和2 g及0.5 g和1 g。在雞蛋空白樣品濃度為0.02 mg/kg添加水平下，隨著(zhù)無(wú)水硫酸鎂含量增加，氟甲腈、氟蟲(chóng)腈硫醚、氟蟲(chóng)腈和氟蟲(chóng)腈砜回收率逐漸變大，當無(wú)水硫酸鎂含量為1.0 g時(shí)，4種目標物的回收率為78%～107.4%，再次增加無(wú)水硫酸鎂質(zhì)量時(shí)，4種目標物的回收率出現明顯下降；而在試驗中選取的氯化鈉的添加質(zhì)量在1 g時(shí)，4種目標化合物的回收率最高?？赡苡捎跓o(wú)水硫酸鎂和氯化鈉含量增加，造成失水嚴重而目標物被包裹在鹽析劑空隙中。因此，選擇1 g無(wú)水硫酸鎂和1 g氯化鈉為鹽析劑。

2.4 凈化劑含量的優(yōu)化

C18作為凈化劑，可以去除雞蛋樣品中脂肪、維生素和甾醇等非極性物質(zhì)，降低雜質(zhì)的影響，減小基質(zhì)效應，保證試驗結果的準確性。試驗考察了加入量分別為5 mg、10 mg、20 mg和30 mg的凈化劑C18對氟甲腈、氟蟲(chóng)腈硫醚、氟蟲(chóng)腈和氟蟲(chóng)腈砜的影響。研究證明C18為10 mg時(shí)，添加濃度為0.02 mg/kg，獸藥的回收率范圍在78%～107.4%。

2.5 基質(zhì)效應、檢出限和定量限

按如下公式計算評價(jià)基質(zhì)對各化合物的基質(zhì)效應：

ME（%）=（B－A）/A×100

式中：ME為基質(zhì)效應；A為初始流動(dòng)相溶液標準曲線(xiàn)的斜率；B為基質(zhì)配制標準曲線(xiàn)的斜率。若20%＞ME＞-20%，則為基質(zhì)效應可以接受，否則存在較強的基質(zhì)抑制或增強效應[9]。根據表2可知，4種藥物在雞蛋中的基質(zhì)效應均在可接受范圍內（20%＞ME＞-20%），為了定量準確，選擇基質(zhì)加標標準曲線(xiàn)法定量。

由表2可知，氟蟲(chóng)腈及其代謝物在10～100 ng/mL范圍內線(xiàn)性關(guān)系較好，相關(guān)系數r≥0.995。以S/N=3和S/N=10計算檢出限（LOD）和定量限（LOQ），4種目標化合物的LOD和LOQ分別為0.162～0.685 µg/kg和0.541～

2.285 µg/kg，滿(mǎn)足雞蛋中多種獸藥殘留的測定需求。

2.6 準確度和精密度

在雞蛋空白樣品添加濃度為0.02 mg/kg水平下，進(jìn)行8次平行試驗。采用基質(zhì)匹配標準曲線(xiàn)進(jìn)行定量分析，由表3可知，4種化合物的平均加標回收率在78.0%～107.4%，相對標準偏差在3.93%～5.66%，方法具有較好的準確度和重現性。

2.7 實(shí)際樣品測定

樣品《食品安全國家標準 雞蛋中氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》（GB 23200.115—2018）和本方法同時(shí)檢測1個(gè)陰性樣品和2個(gè)陽(yáng)性樣品，獲得的結果是一致的，同時(shí)做加標質(zhì)量控制樣品，4種藥物的回收率在75%～112%范圍內。樣品中檢測出氟甲腈，其余藥物均未檢出。根據結果顯示，兩種方法檢測的結果差異小。

3 結論與討論

本文建立了基質(zhì)固相分散-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定雞蛋中的氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留方法。本方法快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、準確，可用于檢測雞蛋中的氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留同時(shí)測定。與現行國家標準及農業(yè)部公告相比，該方法能實(shí)現不同性質(zhì)的多類(lèi)獸藥殘留同時(shí)檢測，大大縮短了檢測周期，節約了檢測成本，為相關(guān)的檢測機構提供了理論依據和技術(shù)支持。

參考文獻

[1]徐有均.雞蛋的營(yíng)養價(jià)值[J].畜牧與飼料科學(xué),2012,33(9):116-117.

[2]黎小鵬,梁雪琪,陳楠,等.超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀檢測動(dòng)物源性食品中氟蟲(chóng)腈及其代謝物[J].安徽農業(yè)科學(xué),2019,47(14):204-206.

[3]鄭仙玨.“毒雞蛋”事件凸顯農藥濫用危害[J].生態(tài)經(jīng)濟,2017,33(10):2-5.

[4]熊雯,易路遙,晏亮,等.QuEChERS-超高效液相色譜-質(zhì)譜法測定鮮蛋中氟蟲(chóng)腈及其代謝物[J].分析儀器,2019(3):41-46.

[5]郝杰,邵瑞婷,姜潔,等.QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞蛋、雞肉中氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留[J].食品科學(xué),2019,40(2):318-323.

[6]勵炯,鄭鋅,王紅青,等.分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定禽蛋中氟蟲(chóng)腈及其代謝產(chǎn)物[J].色譜,2017,35(12):1211-1215.

[7]王愛(ài)軍.氣相色譜法檢測雞蛋中氟蟲(chóng)腈的殘留[J].農產(chǎn)品加工,2019(14):62-64.

[8]馮程程,劉新剛,董豐收,等.5種動(dòng)物源食品中的氟蟲(chóng)腈及其3個(gè)代謝物殘留量檢測[J].植物保護,2019(5):207-213.

[9]國家衛生健康委員會(huì ),農業(yè)農村部,國家市場(chǎng)監督管理總局.食品安全國家標準-雞蛋中氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留量的測定-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法:GB 23200.115—2018[S].北京:中國標準出版社,2018.