超高相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定鮮豬肉中8種磺胺類(lèi)藥物殘留

王 玲，林柯璐

（四川省德陽(yáng)市食品藥品安全檢驗檢測中心，四川德陽(yáng) 618000）

摘 要：磺胺類(lèi)抗生素是目前畜牧業(yè)中常用的一種抗菌藥物，而磺胺類(lèi)抗生素在豬肉當中殘留積累，在被人體吸收后，會(huì )對人體產(chǎn)生毒副作用。因此，對鮮豬肉中磺胺類(lèi)抗生素殘留進(jìn)行檢測具有十分重要的現實(shí)意義。本文采用超高相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定了鮮豬肉中8種磺胺類(lèi)藥物殘留，并對德陽(yáng)市場(chǎng)和超市的30份鮮豬肉進(jìn)行磺胺類(lèi)抗生素殘留的檢測。結果表明，30份樣品檢測結果全部合格，利用該方法對磺胺類(lèi)藥物進(jìn)行定性和定量分析，具有操作簡(jiǎn)單、方法穩定等優(yōu)勢，可滿(mǎn)足檢測和監管要求。

關(guān)鍵詞：鮮豬肉；磺胺類(lèi)藥物殘留；超高效液相色譜-質(zhì)譜法

 

磺胺類(lèi)藥物為人工合成的抗菌藥，具有抗菌譜較廣、性質(zhì)穩定、使用簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，在畜牧業(yè)得到了廣泛應用，養殖戶(hù)在畜牧養殖的過(guò)程當會(huì )使用大量的磺胺類(lèi)抗生素，牲畜被人類(lèi)食用后，會(huì )對人類(lèi)的身體健康造成一定的負面影響。因此，對各種畜牧產(chǎn)品，尤其是鮮肉類(lèi)的產(chǎn)品進(jìn)行磺胺類(lèi)抗生素殘留檢測，是對消費者生命健康的保障，是一項十分重要的工作。

磺胺類(lèi)藥物殘留的常用檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜法等[1]。液質(zhì)聯(lián)用以液相色譜作為分離系統，質(zhì)譜為檢測系統，樣品經(jīng)液相系統進(jìn)入質(zhì)譜系統，被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數分離，經(jīng)檢測器得到質(zhì)譜圖。液質(zhì)聯(lián)用體現了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢的互補，將色譜對復雜樣品的高分離能力與質(zhì)譜具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質(zhì)量與結構信息的優(yōu)點(diǎn)結合起來(lái)，廣泛應用在藥物分析、食品分析和環(huán)境分析等眾多領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290高效液相色譜儀、Agilent 6420質(zhì)譜儀、優(yōu)普UPT-II-10T型超純水儀、湘儀H1850R高速冷凍離心機、梅特勒托利多MS205DU電子天平、上海榮亞RE-300旋轉蒸發(fā)儀、奧特賽恩斯MTN-5800A氮吹儀、IKA VORTEX渦旋儀、KQ-700DV數控超聲儀以及九陽(yáng)破壁機。

磺胺類(lèi)標準品：BePure標準品磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺喹惡啉、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪（濃度100 μg/mL），成都雅源科技C18填料、正己烷（色譜純，諾爾施）、乙腈（色譜純，諾爾施）、正丙醇和甲酸（GR級，成都科龍化工試劑）。

1.2 標準儲備液

分別精確吸取濃度為100 μg/mL磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺喹惡啉、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪標準溶液各1.0 mL于

20 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度線(xiàn)，得5 μg/mL混合標準儲備液，-18 ℃保存。再用甲醇逐級稀釋成100 ng/mL得混合標準儲備液。

1.3 標準工作液配制

分別稱(chēng)取5.00 g空白陰性樣品于50 mL離心管中，處理方法同樣品處理方法一致，制的基質(zhì)溶液。精確吸取適量上述100 ng/mL儲備液于1.5 mL進(jìn)樣瓶中，用空白基質(zhì)溶液定容至1.0 mL，配置成5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、

40 ng/mL、80 ng/mL的混合標準濃度系列。

1.4 實(shí)驗方法

1.4.1 樣品前處理

精確稱(chēng)取試樣2 g置于研缽中，加入6 g C18填料，研磨30 s，裝于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入25 mL乙腈-水溶液，渦旋振蕩1 min，超聲10 min，于6 000 r/min離心5 min，將乙腈層轉移至另一離心管中，離心后沉淀物重復提取一次，合并乙腈溶液，待凈化[2]。

提取液中加入25 mL乙腈飽和正己烷溶液，振搖5 min，將乙腈溶液移入雞心瓶中，加入10 mL正丙醇，45 ℃水浴減壓蒸發(fā)至近干，氮吹至干后，加入1 mL流動(dòng)相初始比列溶液，超聲，溶解殘渣，加入乙腈飽和正己烷渦旋、離心，取底層溶液過(guò)濾，上機待測。

1.4.2 色譜條件

安捷倫C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；流速：0.3 mL/min；流動(dòng)相：0.1%甲酸-水（A），甲醇（B），乙腈（C）；梯度洗脫：0～5 min，A：78%～70%，B：20%，C：2%～10%；5～8 min，A：70%～40%，B：20%，C：10%～40%。

1.4.3 質(zhì)譜條件

離子源：EI；電離模式：電噴霧正離子；采集方式：MRM；離子噴霧電壓：4 000 V；干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流速：11 mL/min；磺胺類(lèi)藥物多反應監測質(zhì)譜優(yōu)化結果見(jiàn)表1，優(yōu)化圖譜見(jiàn)圖1。

2 結果與分析

2.1 實(shí)驗條件優(yōu)化

2.1.1 前處理條件優(yōu)化

處理過(guò)程中比較了乙腈-水、甲醇-水、乙腈、甲醇4種溶劑的提取效果，選用乙腈-水回收率最高且能達到回收率要求，目標物峰形較好，分離度良好，表明乙腈-水的提取效果最優(yōu)。試驗中采用加入正己烷和不加正己烷做對比，得出加入正己烷溶液后除油效果佳，且樣品最后過(guò)濾時(shí)溶液較澄清[3]。

2.1.2 液相條件優(yōu)化

溫度會(huì )影響色譜峰的出峰時(shí)間，隨著(zhù)溫度的增加，色譜峰的出峰時(shí)間提前，使得檢測時(shí)間縮短，但是當溫度過(guò)高，時(shí)間前移較多時(shí)，多種目標物同時(shí)檢測時(shí)峰會(huì )重疊，從而影響分離度。試驗中在25 ℃、30 ℃、35 ℃ 3種液相柱溫下進(jìn)樣測定，得出在30 ℃時(shí)峰的分離度最好，流出時(shí)間短，峰形對稱(chēng)尖銳，所以色譜柱溫度選擇為30 ℃。流動(dòng)相比較了純水、0.1%甲酸水溶液。由于水溶液中加入甲酸，有利于磺胺類(lèi)藥物的離子化，為陽(yáng)離子的形成提供質(zhì)子，同時(shí)甲酸質(zhì)子化色譜柱內的硅羥基，降低了磺胺類(lèi)藥物與羥基形成氫鍵的可能性，從而改善峰形，減少峰拖尾現象。

2.1.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在正離子模式下進(jìn)行母離子的掃描，確定子離子，設定一定范圍內的一組錐孔電壓，選出最優(yōu)的錐孔電壓，在最優(yōu)電壓下，優(yōu)化碰撞能量，通過(guò)子離子信號豐度，選出最優(yōu)的碰撞能量，確定目標物的最優(yōu)質(zhì)譜條件[4]。

2.2 標準曲線(xiàn)及線(xiàn)性范圍

豬肉基質(zhì)復雜，應用高相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測定時(shí)，基質(zhì)對藥物產(chǎn)生基質(zhì)效應，對目標物有增強或抑制效應[5]。因此，為了減小基質(zhì)效應，本試驗采用基質(zhì)表準曲線(xiàn)進(jìn)行定量。用陰性豬肉樣品空白基質(zhì)溶液配制濃度為

5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL的混合標準溶液進(jìn)行測定。以濃度為橫坐標，相應峰響應值為縱坐標繪制標準曲線(xiàn)，線(xiàn)性良好，相關(guān)系數為0.997 6～0.999 9。

8種磺胺類(lèi)藥物線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數、回歸方程見(jiàn)表2。 

2.3 方法準確度

以陰性豬肉樣品作為空白樣品，在空白樣品中加入混合標準溶液，設3個(gè)添加濃度，每個(gè)添加濃度設置6個(gè)重復，以每個(gè)濃度的6個(gè)重復樣品的回收率評價(jià)方法的準確度。添加水平為5 μg/kg、20 μg/kg、50 μg/kg，陰性豬肉樣品的加標回收率在70.7%～101.3%，符合分析要求，見(jiàn)表3。

2.4 精密度

以陰性豬肉樣品作為空白樣品，在空白樣品中加入混合標準溶液，設3個(gè)添加濃度，每個(gè)添加濃度設置6個(gè)重復，以6次測試結果的相對標準偏差評價(jià)方法的精密度，添加水平為5 μg/kg、20 μg/kg、50 μg/kg，陰性豬肉樣品濃度的相對標準偏差在1.2%～3.9%，符合分析要求，見(jiàn)表3。

表3 添加回收率實(shí)驗結果表（n=6）

2.5　實(shí)際檢測驗證試驗

在試驗優(yōu)化的最優(yōu)檢測條件下，對菜市場(chǎng)和超市購買(mǎi)的30份豬肉樣品進(jìn)行磺胺類(lèi)藥物殘留的檢測，均未超過(guò)GB 31650—2019標準中磺胺類(lèi)藥物的殘留限量100 μg/kg的規定。

4 結論

超高相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是一種綜合性檢測技術(shù)，結合了液相色譜的高效分離能力與質(zhì)譜的高靈敏度特點(diǎn)，其色譜柱可多次重復利用，并且檢測結果快速、準確，本文實(shí)驗結果表明將超高相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法應用于食物中殘留藥品檢測，可以滿(mǎn)足對大分子化合物的分離要求，值得進(jìn)一步在食品檢測行業(yè)推廣應用。

參考文獻

[1]馮才偉,朱君紅,王會(huì )玲,等.酶聯(lián)免疫法測定豬肉中磺胺類(lèi)藥物的殘留[J].四川畜牧獸醫,2012,39(2):27-29.

[2]陳振桂,占春瑞,郭平,等.高效液相色譜法同時(shí)測定水產(chǎn)品中13種磺胺類(lèi)藥物殘留的研究[J].食品科學(xué),2007(10):448-451.

[3]王浩,郭啟雷,殷曉燕,等.液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜對牛奶中10種磺胺類(lèi)藥物殘留的同時(shí)測定[J].分析測試學(xué)報,2008(增刊1):137-139.

[4]楊杰程,劉丁溪,郭擾擾,等.動(dòng)物性食品中磺胺類(lèi)藥物殘留檢測方法的研究進(jìn)展[J].畜牧與獸醫,2019,51(6):134-139

[5]鄧櫻花,李林,張洪權,等.高效液相色譜-熒光檢測法測定雞肉中5種磺胺類(lèi)藥物殘留[J].華中第二師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,2014,48(1):53-57.