淺談蛋白質(zhì)含量的測定

張 琳，顧風(fēng)云，秦宇婷，姜卓君，劉傳玉

（吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監督檢驗院，吉林長(cháng)春 130000）

摘　要：蛋白質(zhì)是人體中非常重要的組成成分。蛋白質(zhì)含量測定的常用方法有凱氏定氮法、雙縮脲法、酚試劑法、紫外吸收法及燃燒法等?；诖?，本文對蛋白質(zhì)含量的測定進(jìn)行了研究。

關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)；分析方法；凱氏定氮法

 

蛋白質(zhì)是構成生命的重要物質(zhì)[1]。在人體的細胞和組織中，蛋白質(zhì)是非常重要的組成成分。在人體中，蛋白質(zhì)占了人體質(zhì)量的18%，其與生命現象有著(zhù)密切的關(guān)系。人體內蛋白質(zhì)的種類(lèi)很多，但性質(zhì)和功能各有區別。因此，蛋白質(zhì)的檢測方法就顯得尤為重要。凱氏定氮法是測定蛋白質(zhì)含量最為普遍的方法，同時(shí)相比較于其他檢測方式，其具有更多優(yōu)勢[2]，如易于操作、實(shí)驗過(guò)程安全、成本較為合理、測定結果準確。因此，凱氏定氮法成為食品檢驗工作中普遍的測定方法。

1 實(shí)驗儀器與試劑

實(shí)驗儀器：電子天平（Metteler Toledo ML204）；石墨消解儀（濟南海能儀器股份有限公司）；全自動(dòng)凱氏定氮儀（山東海能科學(xué)儀器有限公司）。

試劑：硫酸銅；硫酸鉀；硫酸；硼酸；氫氧化鈉；甲基紅指示劑；溴甲酚綠指示劑；95%乙醇溶液。

2 實(shí)驗方法

2.1 實(shí)驗原理

食品中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件下被分解，產(chǎn)生的氨和硫酸結合生成硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或者鹽酸標準滴定溶液滴定，根據酸的消耗量計算氮含量。凱氏定氮法的反應過(guò)程包含以下幾個(gè)方面。

消化：蛋白質(zhì)+濃硫酸硫酸銨+二氧化碳+二氧化硫+水

蒸餾：氫氧化鈉+硫酸銨→氨氣+硫酸鈉+水

吸收：氨氣+硼酸→硼酸銨+水

滴定：硼酸銨+水+鹽酸→氯化銨+硼酸

2.2　滴定注意事項

在滴定過(guò)程中需要注意以下兩點(diǎn)。①指示劑為甲基紅溴甲酚綠，其在堿性條件下變藍，酸性條件下暗變紅。②催化定氮片。硫酸銅催化劑；硫酸鉀防止暴沸。

2.3 樣品處理及實(shí)驗步驟分析

①稱(chēng)量。固體試樣0.2～2 g、半固體試樣2～5 g，液體試樣10～25 g。②消化。于消化管中加入硫酸銅、硫酸鉀，10 mL濃硫酸后，放置石墨消解爐上消解90 min，消解溫度為420 ℃，消解儀可選用曲線(xiàn)加熱模式和直線(xiàn)加熱模式。③上機。消解后的樣品冷卻后，可上機測試。上機測試前，需要對機器進(jìn)行清洗，包括接受杯、堿管路，機器，清洗完畢后，先測試空白樣品，再測試樣品。④計算。根據公式可知，試樣的質(zhì)量、試劑空白滴定液體積、試樣滴定液體積和氮換算為蛋白質(zhì)的系數是變量，因此，實(shí)驗過(guò)程中需要關(guān)注天平的準確性、消解是否完全、機器清洗是否干凈、空白試劑的滴定體積數以及試驗滴定液體積數是否準確。

3 儀器常規維護保養

①儀器要有良好的通風(fēng)和散熱條件。②儀器測試時(shí)首先進(jìn)入清洗界面選擇，換酸清洗3次左右，當改變滴定酸的濃度時(shí)，用換酸清洗的方法將管路及滴定器中的滴定酸排凈，再用新?lián)Q酸沖洗至少6次，并及時(shí)排液。③測樣前連續做儀器空白測試[3]。等到儀器穩定后可測試樣品（將機器中的堿量調為零，進(jìn)行測試，當滴定體積之差小于0.05 mL，機器即為穩定）。④每日實(shí)驗結束后，清洗接收杯1～2次以及堿管路2次，用洗瓶沖洗蒸餾頭殘余堿液。儀器前部的槽皿中，如果積有液體，將其擦洗干凈。⑤為了延長(cháng)防濺裝置的使用壽命，請每天工作結束后清洗，即消化管內加入一半左右的蒸餾水（以蒸餾完成消化管液體不溢出為準），上機蒸餾，一般清洗2次左右（空蒸儀器把加堿量設置為“0”）。⑥儀器使用結束后要關(guān)閉水源、電源，儀器上要安裝空消化管（防止防濺裝置內殘留液體流到儀器上）。⑦為防止堿路結晶影響儀器壽命，在完成實(shí)驗后，進(jìn)行堿管路清洗。若儀器長(cháng)時(shí)間不用或者使用時(shí)間一周以上時(shí)，應將堿桶中的堿液換為蒸餾水；將消化管放好，選擇手動(dòng)加堿，達到清洗管路的作用，防結晶堵塞。⑧堿液桶、硼酸液桶應定期清理沉淀物并清洗干凈。⑨儀器長(cháng)期使用，在蒸餾瓶中會(huì )有水垢產(chǎn)生，將影響加熱效率（建議6個(gè)月清理1次）；如使用頻繁，可增加清洗頻率[4]。通過(guò)加蒸餾水管路加入除垢劑或一定濃度的弱酸性溶液清洗干凈，按蒸餾水排水閥排凈，再用蒸餾水多次沖洗后將管路連接好。⑩如儀器存放環(huán)境溫度低于零度以下應排空儀器內所有液體，以免造成儀器損壞。

4 注意事項

①實(shí)驗前，試劑要準備充足，保證滿(mǎn)足本批次實(shí)驗；②開(kāi)機前要打開(kāi)冷卻循環(huán)水，保證冷卻效果；③強酸強堿反應劇烈，建議設置加10～20 mL蒸餾水進(jìn)行稀釋?zhuān)虎芴砑託溲趸浫芤旱捏w積數為濃硫酸體積的4倍，最為適宜；⑤開(kāi)始進(jìn)行蒸餾時(shí)，消化管中液體的總體積以不超過(guò)總體積的1/3為宜；⑥拿取消化管的過(guò)程中需要注意高溫燙傷。在放置消化管時(shí)，需要左右旋轉幾下，確保消化管與蒸餾頭密封；⑦禁止使用邊緣有缺口，或者有裂縫的消化管；⑧儀器蒸餾過(guò)程中如遇緊急情況，可直接關(guān)閉電源開(kāi)關(guān)；⑨排廢液管的出口要比儀器安放位置低，以使排液暢通。

5 實(shí)際應用與現狀

在目前檢測中，食品中蛋白質(zhì)含量測試參照《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》（GB 5009.5—2016）、《飼料中粗蛋白的測定 凱氏定氮法》（GB/T 6432—2018），同時(shí)，凱氏定氮儀還可以測定食品中揮發(fā)性鹽基氮的含量，參照標準為GB 5009.228—2016以及測定大豆肽粉中多肽含量，參照標準為GB/T 22492—2008。凱氏定氮法測量蛋白質(zhì)含量最為合適[5]。蛋白質(zhì)的測定有凱氏定氮法、雙縮脲法、酚試劑法、紫外吸收法和燃燒法，其具體操作及特點(diǎn)如下。

5.1 凱氏定氮法

準備4個(gè)50 mL凱氏燒瓶并標號，向1、2號燒瓶中加入定量的蛋白質(zhì)樣品，另外兩個(gè)燒瓶作為對照，在每個(gè)燒瓶中加入硫酸鉀-硫酸銅混合物，再加入濃硫酸，將4個(gè)燒瓶放到消化架上進(jìn)行消化，之后進(jìn)行蒸餾，全部蒸餾完畢后用標準鹽酸滴定各燒瓶中收集的氨量，直至指示劑混合液由綠色變回淡紫紅色，即為滴定終點(diǎn)，結算出蛋白質(zhì)含量。

5.2 雙縮脲法

雙縮脲法是第一個(gè)用比色法測定蛋白質(zhì)濃度的方法，硫銨不干擾顯色，Cu2+與蛋白質(zhì)的肽鍵以及酪氨酸殘基絡(luò )合，形成紫藍色絡(luò )合物，此絡(luò )合物在540 nm波長(cháng)處有最大吸收。首先利用標準蛋白溶液和雙縮脲試劑繪制標準曲線(xiàn)，將待測血清與硫酸鈉在待測試管中混合[6]，并用只加入硫酸鈉不含血清的試管作為對照，將兩支試管加入等量的雙縮脲試劑，充分混合后于37 ℃環(huán)境中放置10 min，在540 nm波長(cháng)處進(jìn)行比色，以對照管調零，讀取吸光度值，由標準曲線(xiàn)上直接查出蛋白質(zhì)含量。雙縮脲法常用于0.5～10 g/L含量的蛋白質(zhì)溶液測定。

5.3 酚試劑法

取6支試管分別標號，前5支試管分別加入不同濃度的標準蛋白溶液，最后一支試管加待測蛋白質(zhì)溶液，不加標準蛋白溶液，每支試管液體總量通過(guò)加入蒸餾水補足而保持一致，將液體混合均勻，在室溫下放置30 min，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照，于650 nm波長(cháng)處測定各管中溶液的吸光度值。

5.4 紫外吸收法

大多數蛋白質(zhì)在280 nm波長(cháng)處有特征的最大吸收，這是由于蛋白質(zhì)中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于測定0.1～0.5 mg/mL含量的蛋白質(zhì)溶液。取9支試管分別標號，前8支試管分別加入不同濃度的標準蛋白溶液，1號試管不加標準蛋白溶液，最后一支試管加待測蛋白質(zhì)溶液[7]，而不加標準蛋白溶液，每支試管液體總量通過(guò)加入蒸餾水補足而保持一致，將液體混合均勻[8]，在280 nm波長(cháng)處進(jìn)行比色，記錄吸光度值。

5.5 燃燒法

試樣在900～1 200 ℃高溫下燃燒，燃燒過(guò)程中產(chǎn)生混合氣體，其中碳、硫等干擾氣體和鹽類(lèi)被吸收管吸收，氮氧化物被全部還原成氮氣，形成的氮氣氣流通過(guò)熱導檢測器進(jìn)行檢測。此方法易操作[9]，但需要購買(mǎi)氮/蛋白質(zhì)分析儀，采購費用比較昂貴。

參考文獻

[1]張美娜.分光光度法在食品添加劑測定中的應用[J].糧食科技與經(jīng)濟,2018,43(9):54-56.

[2]曹坎濤.蛋白質(zhì)測定方法改進(jìn)[J].河北化工,2011,34(10):26-27.

[3]莫佳琳,張思原,陸海勤,等.鉬酸銨分光光度法檢測糖廠(chǎng)工業(yè)磷酸含量的應用研究[J].甘蔗糖業(yè),2015(1):52-56.

[4]吳賀標,張順紅.分光光度法檢測的應用及分析[J].啤酒科技,2001(10):51.

[5]李官慧.紫外-可見(jiàn)分光光度法在食品檢測及食品安全分析中的應用[J].中國標準化,2017(22):72-73.

[6]李婷.分光光度法在食品檢測中的應用標準研究[J].中國標準化,2017(16):57-58.

[7]郝麗紅.分光光度法在食品檢測中的應用標準研究[J].飲食科學(xué),2017(14):12.

[8]湯亞芳.分光光度法在食品添加劑測定中的應用[J].廣東化工,2016,43(10):209.

[9]董宇芳,潘臨平.PAN萃取食品中錳的分光光度法的方法探討[J].山西食品工業(yè),1998(2):39-40.