□李煒 韋素梅 劉運龍 廣西壯族自治區糧油科學(xué)研究所
　　摘 要: 將氯霉素多克隆抗體與瓊脂糖凝膠偶聯(lián),制備了對氯霉素有特異性吸附作用的微型氯霉素免疫親和色譜柱，并對色譜柱進(jìn)行了評價(jià)。該微型氯霉素免疫親和色譜柱的動(dòng)態(tài)柱容量為52720μg/L，富集極限可以達到100ng/L，對氯霉素的回收率達到98.5%以上，可以重復使用2次。該色譜柱可以有效消除基質(zhì)的影響, 提高檢測的靈敏度,可應用于乳制品等食品中氯霉素殘留的樣品快速前處理。
　　關(guān)鍵詞:氯霉素 免疫親和柱 檢測
　　氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是一種廣譜抗生素。醫學(xué)臨床和獸醫曾用來(lái)治療人及動(dòng)物的多種感染性疾病。但氯霉素對造血系統有嚴重的毒副作用[1, 2]，已被臨床醫學(xué)和動(dòng)物生產(chǎn)上禁止使用。我國規定在動(dòng)物可食用組織不得檢出[3]。但由于氯霉素價(jià)格低廉，效果明顯，仍存在違規使用、屢禁不止的情況，導致食品中氯霉素的殘留現象依然十分嚴重[4]，對人體健康危害極大。
　　目前檢測食品中氯霉素殘留的方法主要包括:薄層層析法、高效液相色譜法[5]、氣相色譜法[6-8]、和液相色譜-質(zhì)譜法[ 9, 10]、氣相色譜-質(zhì)譜法等[11]、免疫學(xué)檢測方法等[12-14]。無(wú)論何種檢測方法，對樣品純度的要求較高,檢測前必須對樣品進(jìn)行凈化處理。由于生物樣本成分復雜，殘留的氯霉素濃度低，且大多數取樣量少，常規的樣品前處理方法繁瑣、耗時(shí)長(cháng)、成本高。免疫親和色譜(IAC)是以抗原抗體的特異性、可逆性免疫結合反應為原理的色譜技術(shù)，最顯著(zhù)優(yōu)點(diǎn)在于對待測物的高效、高選擇性保留能力，特別適用于復雜樣品痕量組分的凈化與富集[15-17]。使用免疫親和色譜純化富集樣品中的氯霉素，可以很大程度的簡(jiǎn)化和加快檢測流程，提高分析結果的準確性、可靠性和分析的極限。
　　本文中研制的微型氯霉素免疫親和色譜柱具有濃縮待測樣品中氯霉素濃度、降低檢測下限、排除雜質(zhì)干擾、提高檢測結果的準確性和可靠性、減少樣品過(guò)柱時(shí)間的作用，為氯霉素的分析檢測提供了快速高效的前處理手段。
　　1 材料與方法
　　1.1 主要試劑與儀器
　　氯霉素多克隆抗體(南寧市藍光生物技術(shù)有限公司);過(guò)碘酸氧化的瓊脂糖凝膠(sigma，A9951);硼氫化鈉(分析純);碳酸鈉(分析純);氯霉素標準品(Sigma，C0378);氯霉素氘代內標(氯霉素-D5);0.01mol/L磷酸氫鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(PBS),pH7.4;洗滌液為含0.05% Tween-20的PBS溶液(PBST);洗脫液(3%乙酸-80%甲醇水溶液);飽和tris溶液;色譜純甲醇;色譜純乙腈;色譜純正己烷;色譜純正丙醇。
　　分析天平(上海天平儀器廠(chǎng));可調試移液器(美國雷勃公司);旋轉蒸發(fā)儀(上海荊和分析儀器有限公司);離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng));渦旋混合器(德國IKA集團) ;液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜(美國AB SCIEX公司)。
　　1. 2 試驗方法
　　1.2.1 免疫親和柱的制備
　　用50mL濃度為0.1mol/L碳酸鈉溶液溶解1g氯霉素多克隆抗體，與40mL的過(guò)碘酸氧化的瓊脂糖凝膠在室溫下反應30min后，于4℃冰箱靜置30min，然后加入50mg硼氫化鈉還原穩定，清洗后，得到富集氯霉素的免疫親和色譜填料。取25μL填料裝入容量為0.25mL的親和層析塑料柱中，填料兩頭分別加上1個(gè)孔徑為50μm的篩板，篩板剛好與填料接觸后得到微型富集氯霉素的免疫親和色譜柱。往柱里加入100μL甘油，3-8℃下保存，待用。
　　1.2.2 免疫親和柱的使用方法
　　將氯霉素親和柱取出，室溫平衡10min后依次加入1mL PBST、2mL PBS、200μL 洗脫液、1mL PBST清洗柱子，用5mL PBS平衡柱子后加入待測樣品，自然重力下流出，棄去流出液，待樣品滴凈后，依次加入2mL PBST、2mL PBS清洗，然后加入適量洗脫液(0.2mL—1mL)，用2mL的離心管收集洗脫液，待測。
　　1.2.3 樣品的加標回收
　　稱(chēng)取陰性牛奶樣品5g(精確至0.01g),置于50ml離心管中，加入100ng氯霉素標準品和等量的氯霉素氘代內標(氯霉素-D5)，混勻后加入乙腈30mL,勻漿，離心5min。將上清液移250mL的分液漏斗中，加入15mL的乙腈飽和的正己烷，振蕩5min，靜置分層，轉移乙腈層至100mL的圓底燒瓶中，殘渣中再加入30mL的乙腈，振搖3min，離心5min，取上清液轉移到同一分液漏斗中，振蕩5min，靜置分層，轉移乙腈層至同一圓底燒瓶中。向燒瓶中加入5mL正丙醇，于40℃水浴中旋轉蒸發(fā)近干，分次加入15mL PBS溶解,全部轉移至離心管中，取飽和tris溶液調節提取液使pH值接近中性，待親和柱凈化。
　　1.2.4 檢測方法
　　按照GB/T22338-2008動(dòng)物源性食品中氯霉素類(lèi)藥物殘留量測定方法，采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測定洗脫液中的氯霉素含量。
　　2 結果與分析
　　2.1 容量試驗
　　將氯霉素標準品用PBS配制成5mL濃度為2μg/mL的氯霉素溶液作為待測樣品，待測樣品過(guò)柱后加入1mL洗脫液洗脫，檢測洗脫液中氯霉素質(zhì)量，計算出動(dòng)態(tài)柱容量(指每毫升填料對氯霉素的最大吸收值)。上述實(shí)驗重復3次，結果見(jiàn)表1。 　　3次重復實(shí)驗的結果表明，該25μL的微型氯霉素免疫親和色譜柱的平均動(dòng)態(tài)柱容量為1.318μg/25μL，即52720μg/L 填料。說(shuō)明該微型氯霉素免疫親和色譜柱的吸附能力很強，能有效富集氯霉素分子。
　　2.2 極限試驗
　　將氯霉素標準品用PBS配制成10mL濃度分別為100ng/L、200ng/L 的氯霉素溶液作為待測樣品，并以10mL PBS作為空白待測樣品。待測樣品分別過(guò)柱后加入0.2mL洗脫液洗脫，將洗脫液定容至1mL后，檢測洗脫液中氯霉素的質(zhì)量，測試微型氯霉素免疫親和色譜柱的富集極限。上述實(shí)驗重復2次，結果見(jiàn)表2。 　　由上表可以看出，該微型氯霉素免疫親和色譜柱的富集極限可以達到100ng/L，即0.1ppb，樣品經(jīng)色譜柱富集濃縮后，樣品濃度由由原來(lái)的100ng/L、200ng/L富集到1001ng/L、2430ng/L，富集率可達10倍。在儀器檢出限不變的情況下, 使用該色譜柱可以使樣品分析方法的檢出限降低10倍。
　　2.3 回收率試驗
　　將氯霉素標準品用PBS分別配制成100mL濃度為100ng/L、20mL濃度為500ng/L、4mL濃度為2.5μg/L的氯霉素溶液作為待測樣品，并以20mL PBS作為空白待測樣品。待測樣品分別過(guò)柱后加入0.2mL洗脫液洗脫，檢測洗脫液中氯霉素的質(zhì)量，計算回收率。上述實(shí)驗重復2次，結果見(jiàn)表3。 　　由上表可以看出，該微型氯霉素免疫親和色譜柱對氯霉素的回收率較高，達到了98.5%以上。
　　2.4 使用次數試驗
　　將氯霉素標準品用PBS配制成10ml濃度為1000ng/L的氯霉素溶液作為待測樣品，待測樣品過(guò)柱后加入0.2mL洗脫液洗脫。同一根微型柱使用1次之后再重復使用2次，總共使用次數為3次。分別收集每次過(guò)柱后的洗脫液，檢測洗脫液中氯霉素的質(zhì)量。上述實(shí)驗重復3次，結果見(jiàn)表4。
　　由上表可以看出，隨著(zhù)使用次數的增多，微型氯霉素免疫親和色譜柱的回收率逐漸下降，在使用第3次后其回收率均明顯下降，因此該微型氯霉素親和色譜柱最多可以使用2次。
　　2.5 樣品加標回收試驗
　　將添加了氯霉素標準品和等量氯霉素-D5的待測牛奶樣品過(guò)柱后加入0.3mL洗脫液洗脫，洗脫液經(jīng)0.45μm的濾膜過(guò)濾后，檢測洗脫液中氯霉素的質(zhì)量，計算回收率。上述實(shí)驗重復3次，并設一個(gè)空白對照，結果見(jiàn)表5。
　　以上實(shí)驗結果表明，該微型氯霉素免疫親和色譜柱可以有效的富集牛奶中的氯霉素，消除牛奶基質(zhì)對儀器檢測氯霉素的影響，具有較好的回收率。
　　3 小結
　　實(shí)驗證明，本文研制的微型氯霉素免疫親和色譜柱對氯霉素具有很高的富集率、靈敏度和回收率，可以消除樣品雜質(zhì)的影響，將樣品中的氯霉素富集10倍以上，對氯霉素的吸附容量達到52720μg/L填料，富集極限可以達到100ng/L，回收率達到98.5%以上，可以重復使用2次。
　　微型氯霉素免疫親和色譜柱具有很強的氯霉素結合力，可選擇性吸附樣品液中的氯霉素，從而對氯霉素樣品起到特異性純化和富集的作用。由于填料的吸附容量大，填料裝柱體積少(25μL)，樣品過(guò)柱洗脫的時(shí)間短，洗脫體積少，洗脫液既可以直接結合ELISA測試盒或膠體金試紙條進(jìn)行檢測，也可以直接聯(lián)合液相色譜等儀器分析方法進(jìn)行精確定量。使用微型氯霉素免疫親和色譜柱可以高效、可靠、快速簡(jiǎn)便的富集氯霉素，改善信噪比，提高檢測方法的準確度。
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