摘　要：據美國農業(yè)部農業(yè)經(jīng)濟研究部門(mén)最新數據統計顯示，沙門(mén)氏菌每年在美國導致的醫療花費達到37億美元，這個(gè)數據將沙門(mén)氏菌排在了美國食源性疾病花費最高的15大致病菌之首。另外，一系列沙門(mén)氏菌引起的食物中毒事件也表明，沙門(mén)氏菌早已成為全球最常見(jiàn)的食源性致病菌之一。傳統沙門(mén)氏菌檢測技術(shù)存在耗時(shí)、繁瑣、低效等缺點(diǎn)，故快速、靈敏、可靠的新型快速檢測技術(shù)成為研究熱點(diǎn)。將免疫學(xué)和生物化學(xué)技術(shù)有機結合，利用微生物特異性免疫磁珠和微生物測試片實(shí)現待檢致病菌的雙重篩選，大大提高了沙門(mén)氏菌檢測的特異性，靈敏度明顯高于同類(lèi)產(chǎn)品，并大幅度縮短檢測時(shí)間。

    關(guān)鍵詞：沙門(mén)氏菌　食源性致病菌　免疫磁珠　測試片
    世界范圍內食品安全惡性事件接連發(fā)生，食品安全形勢嚴峻，衛生部統計公告的食物中毒人數逐年遞增，且食源性致病菌引起的占據首位^[1]。據WHO估計，全世界每年的食源性疾病患者中，70%都是由致病性微生物所引起^[2]。沙門(mén)氏菌主要污染肉及肉制品、蛋制品、奶制品等，雞是沙門(mén)氏菌的天然宿主，感染了沙門(mén)氏菌的雞肉制品是引起人沙門(mén)氏菌感染的主要途徑。市場(chǎng)上的零售雞肉，沙門(mén)氏菌陽(yáng)性檢出率高達50%。所以，開(kāi)發(fā)快速、高效、準確的食源性致病菌快速檢測方法已成為保障食品安全和防止疾病傳染的關(guān)鍵。

    1 沙門(mén)氏菌檢測方法
    國標規定，食品中沙門(mén)氏菌的檢測主要是培養法和生理生化檢測法，該檢測法的特點(diǎn)是方法經(jīng)典，但缺點(diǎn)是操作繁瑣、試劑繁多、耗時(shí)較長(cháng)，一個(gè)完整檢測周期需要大約5~7天時(shí)間，遠遠不能夠滿(mǎn)足檢測要求。目前，應用較多的快速檢測法主要是即用培養法、免疫學(xué)法、分子生物學(xué)方法等。免疫學(xué)技術(shù)的優(yōu)勢是特異性高、耗時(shí)間短、結果可靠，適合批量檢測和自動(dòng)化檢測；依賴(lài)于專(zhuān)業(yè)儀器分子學(xué)方法的優(yōu)勢是靶標明確、時(shí)間短、結果可靠，明顯的不足則是引物和探針的選擇及設計不當，可能降低靈敏度和特異性^[3]；技術(shù)設備要求高，熒光探針價(jià)格昂貴，另外容易造成交叉污染是核酸法不能回避的問(wèn)題等。
    因此，設計和開(kāi)發(fā)出特異性好、檢測時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便的沙門(mén)氏菌快速檢測技術(shù)對于食品安全領(lǐng)域的微生物快速檢測具有重要意義。

    2 磁在快沙門(mén)氏菌測試盒原理
    免疫磁性分離技術(shù)，又稱(chēng)為免疫磁珠法，可直接從樣品或前增菌培養物中分離目的細菌。磁珠上包被能夠特異識別目標細菌的抗體，通過(guò)抗原抗體反應從而形成一個(gè)磁珠和細菌的復合體，再通過(guò)磁場(chǎng)將磁珠收集使目標菌得到有效地富集和分離^[4]，大大縮短前增菌時(shí)間。
    微生物測試片是應用傳統的微生物培養方法和現代生化鑒定技術(shù)相結合的檢測技術(shù)。測試片的載體中含有可供目標生長(cháng)的營(yíng)養成分，選擇劑以及特異酶顯色底物，通過(guò)直接觀(guān)察菌落顏色即可對細菌種類(lèi)做出鑒定，是一種簡(jiǎn)單、方便、經(jīng)濟的檢測方法。
    磁在快檢測試劑盒將兩種檢測方法結合，通過(guò)特異性免疫磁珠和微生物測試片對微生物進(jìn)行雙重篩選，提高了沙門(mén)氏菌檢測的特異性。對于食品檢測中的復雜樣本，通過(guò)免疫磁珠的富集，能夠有效去除干擾檢測的雜質(zhì)，并對樣本具有濃縮作用，靈敏度明顯高于同類(lèi)產(chǎn)品，大幅度縮短增菌時(shí)間，整個(gè)檢測過(guò)程在24h內可完成。同時(shí)，操作簡(jiǎn)單，不需要大型設備，可以節約空間、降低檢測成本。

    3 磁在快沙門(mén)氏菌測試盒驗證方案
    3.1 識別性和特異性
    選取沙門(mén)氏菌標準菌株及分離株按照標準方法進(jìn)行培養擴增，同時(shí)計數，稀釋到測試所需濃度（100CFU/mL）。
    磁在快測試方法為：取1mL分別加入到2mL的富集管中，放置37℃，150rpm/min震蕩孵育15min，磁力富集，去上清，向菌株富集管中加入1mL清洗液，混勻磁力富集，向菌株富集管中加入1mL重懸緩沖液。使用移液管將菌株富集管中的混合物均勻滴加在沙門(mén)氏菌測試片上，37℃，培養18h。培養結束后，計數所有測試片上顯示出藍色的菌落。
    對照方法為將1mL菌液直接涂布于LB平板中，37℃培養24h，計數所有生長(cháng)菌落。
    3.2 不同菌濃度的回收效率
    選取鼠傷寒沙門(mén)氏菌（ATCC14028）按照標準方法進(jìn)行培養擴增，同時(shí)計數，梯度稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度取1mL，按照3.1所示方法進(jìn)行測定。
    3.3 不同體積的回收效率
    選取鼠傷寒沙門(mén)氏菌（ATCC14028）按照標準方法進(jìn)行培養擴增，同時(shí)計數，稀釋到100CFU/mL，100 CFU/5mL，100 CFU/10mL，100CFU/25mL，按照3.1所示方法進(jìn)行測定。
    3.4 生鮮乳和豬肉中沙門(mén)氏菌的檢測方法
    生鮮乳樣品20份，采自北京某奶廠(chǎng)，4℃進(jìn)行保藏；豬肉樣品20份，購于北京某批發(fā)市場(chǎng)。
    生鮮乳：取樣品25mL，加入磁珠，震蕩15min，磁力富集，去上清，向菌株富集管中加入1mL清洗液，混勻磁力富集，向菌株富集管中加入1mL重懸緩沖液。使用移液管將菌株富集管中的混合物均勻滴加在沙門(mén)氏菌測試片上，37℃，培養18h。培養結束后，計數所有測試片上顯示出藍色的菌落。
    豬肉：取樣品25g，用20mLBPW均質(zhì)，將均質(zhì)液加入磁珠富集管中，37℃，震蕩4h，磁力富集，去上清，向菌株富集管中加入1mL清洗液，混勻，磁力富集，向菌株富集管中加入1mL重懸緩沖液。使用移液管將菌株富集管中的混合物均勻滴加在沙門(mén)氏菌測試片上，37℃，培養18h。培養結束后，計數所有測試片上顯示出藍色的菌落。
    對照方法：取樣25g，按照GB 4789.4-2010的方式進(jìn)行測定。
    4 結果分析
    4.1 識別性和特異性
    通過(guò)檢測，磁在快檢測系統對沙門(mén)氏菌A、B、C、D、E不同血清型及常見(jiàn)沙門(mén)氏菌均可以有效富集及擴增（富集率＞75%），對干擾菌大腸桿菌、糞腸球菌、奇異變形桿菌均能有效的抑制（均未生長(cháng)），方法識別性和特異性良好。     4.2 不同菌濃度的回收效率
    經(jīng)測定，初始菌濃度為1.3×10⁶CFU/mL，通過(guò)不同菌濃度測試，磁在快檢測系統磁珠富集容量大于5×10⁵CFU/mL，同時(shí)菌濃度處于10~10⁵CFU/mL時(shí)，菌的回收率均大于85%。     4.3 不同體積的回收效率
    結果顯示，隨著(zhù)體積的增大，磁在快檢測方法的回收率略有下降，從91.6%下降為78.8%，但是回收率仍大于75%，符合測試要求。     4.4 生鮮乳和豬肉中沙門(mén)氏菌的檢測方
    檢測樣本也同時(shí)采用了國標法對樣本進(jìn)行對比檢測，本實(shí)施例中的測試結果與國標法檢測結果一致。各樣本的定性檢測結果如表4所示。實(shí)驗結果顯示20例豬肉樣本中有5例檢出含有沙門(mén)氏菌，20例牛奶樣本有0例檢出含有沙門(mén)氏菌。
    經(jīng)過(guò)比對，4份樣品磁在快方法和GB 4789.4-2010方法一致，1份不一致從磁在快測試片挑取菌落經(jīng)鑒定為沙門(mén)氏菌。     5 結論
    通過(guò)實(shí)驗驗證，磁在快檢測方法對沙門(mén)氏菌的捕獲率均在80%以上，并有較高的特異性；免疫學(xué)結合生物化學(xué)技術(shù)快檢方法與國標法相比較，測試結果與國標法檢測結果一致，準確性無(wú)顯著(zhù)性差異，靈敏度達到10個(gè)cfu以下。測試片可直接觀(guān)察菌落顏色即可對菌類(lèi)做出鑒定，是一種高效、精準、操作簡(jiǎn)單的檢測方法。免疫學(xué)結合生物化學(xué)技術(shù)快檢方法優(yōu)化了食品安全檢測人員的工作方式，提高工作效率和檢測可信度，對于中國食品安全的發(fā)展具有重大意義。
    6 展望
    食源性致病菌檢測技術(shù)在不斷的發(fā)展和創(chuàng )新過(guò)程中，每種技術(shù)都有各自的優(yōu)勢。多種技術(shù)的聯(lián)用可大大提高檢測的靈敏度，并縮短檢測時(shí)間。隨著(zhù)微生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科的飛速發(fā)展，各種多功能微生物檢測系統的研發(fā)正逐步成為熱點(diǎn)。
    參考文獻：
    [1] 孫秀蘭,蔣棟磊,張銀志.生物傳感器應用于食源性致病菌檢測研究進(jìn)展[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2011，23(11):1040-1042.
    [2] Groundwater P W,Todd A,Worsley A J,et al. The technology andtechniques used in the detection of pathogenic bacteria[J].Pharmaceuticaljournal，2009，283(7569):281-282.
    [3] 石曉路,扈慶華,張佳峰,等.多重實(shí)時(shí)PCR 快速同時(shí)檢測沙門(mén)菌和志賀菌[J].中華流行病學(xué)雜志，2006,27(12):1053-1056.
    [4] Fitzmaurice J, Duffyb G, Kilbride B, et al. Comparison of a membrane surface adhesion recovery method with an IMS method for use in a polymerase chain reaction method to detect Escherichia coli O157:H7 in minced beef[J]. Journal of microbiological methods,2004,59:243-252.