多重PCR法在食品中致瀉大腸埃希氏菌質(zhì)控考核中的應用

2018-05-30 15:29:14 來(lái)源：食品安全導刊

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　　摘要：目的通過(guò)多重PCR方法檢測質(zhì)控樣本中致瀉性大腸埃希氏菌方法：參照GB4789.6-2016《食品安全國家標準食品微生物學(xué) 致瀉大腸埃希氏菌菌檢驗》進(jìn)行檢驗，結果編號15-1樣品檢出EHEC,15-2樣品檢出ETEC。本實(shí)驗室順利完成考核，結果與考核方一致。結論：多重PCR法在質(zhì)控考核中，能夠對目標菌快速鑒別，能夠快速順利完成質(zhì)控考核，同時(shí)了解該實(shí)驗室檢驗能力和實(shí)驗室質(zhì)控水平，提高檢驗機構出具檢驗數據的可靠性和有效性，保證實(shí)驗室的檢測水平。

　　關(guān)鍵詞：質(zhì)控考核；致瀉大腸埃希氏菌；多重PCR

　　1.引言

　　大腸埃希氏菌俗稱(chēng)大腸桿菌，是人類(lèi)和動(dòng)物的腸道中重要的正常菌群，為宿主提供一些有營(yíng)養作用的合成代謝產(chǎn)物。多數大腸埃希氏菌并不致病，當機體抵抗力下降或侵入腸外組織或器官時(shí)，可作為條件致病菌而引起腸道外的感染，引起胃腸炎的大腸埃希氏菌分為五類(lèi)即腸致病性大腸埃希氏菌(EPEC)、腸產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌(ETEC)、腸侵襲性大腸埃希氏菌(EIEC)、腸出血性大腸埃希氏菌(EHEC)和粘附性腸埃希氏菌(EAEC)[1]?？焖贆z測和鑒定病原菌是及時(shí)有效地控制與預防傳染病傳播的重要手段。傳統的微生物學(xué)分離與鑒定以及血清學(xué)方法在鑒別與鑒定病原微生物方面日益顯現出不足。PCR法快速、敏感、特異，是對病原菌快速鑒別與分型的重要技術(shù)之一，而多重PCR更以其突出的優(yōu)越性得到了廣泛的應用[2]。

　　2.材料與方法

　　2.1樣品

　　樣品編號為15-1,15-2，每份考核樣品包含西林瓶1個(gè)，西林瓶中裝有白色凍干菌球。本次考核共計2份樣品。

　　2.2試劑及儀器

　　營(yíng)養肉湯、腸道菌增菌肉湯、麥康凱瓊脂(MAC)、伊紅美藍瓊脂(EMB)、三糖鐵(TSI)瓊脂、大腸埃希氏菌生化套盒、無(wú)菌雙蒸水，以上試劑均使用北京路橋。五種致瀉大腸埃希氏菌DNA提取試劑盒、多重PCR及實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒均使用北京卓誠惠生，實(shí)時(shí)定量PCR儀器（BIO-RAD公司），凝膠成像儀（BIO-RAD公司），電泳儀。

　　2.3試驗方法

　　按照GB4789.6-2016《食品安全國家標準食品微生物學(xué) 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》[2]開(kāi)始檢測。

　　2.3.1樣品前處理與預增菌

　　待質(zhì)控樣品恢復至室溫，無(wú)菌開(kāi)啟瓶蓋，將西林瓶中的白色菌球完全溶解于50mL無(wú)菌生理鹽水中,作為樣本。

　　2.3.2以無(wú)菌操作量取檢樣25mL，加入裝有225mL營(yíng)養肉湯的無(wú)菌袋中，振蕩混勻。將營(yíng)養肉湯增菌液放置于36℃培養18h（增菌時(shí)間延長(cháng)）。取1mL（加樣量增大）,接種于30mL腸道菌增菌肉湯管內，于42℃培養18h。

　　2.3.3分離

　　將增菌液劃線(xiàn)接種MAC和EMB瓊脂平板，于36℃培養24h，觀(guān)察菌落特征。

　　2.3.4生化鑒定

　　選取平板上10個(gè)可疑菌落,分別接種TSI斜面。同時(shí)將這些培養物分別接種蛋白胨水、尿素瓊脂(pH7.2)、KCN肉湯和營(yíng)養瓊脂平板，于36℃培養24h。

　　2.3.5PCR確證試驗

　　使用1μL接種環(huán)刮取營(yíng)養瓊脂平板上的菌落，懸浮于200μL滅菌雙蒸水中，充分打散制成菌懸液，13000r/min離心3min，棄掉上清液。加入50μL充分震蕩混勻的核酸提取液，于100℃金屬浴維持10min，13000r/min離心3min，收集上清液，取2μL作為PCR檢測的模板。

　　3.結果與分析

　　4.討論與分析

　　本實(shí)驗室自2014起，參與國家食品風(fēng)險監測項目，并開(kāi)始使用多重PCR技術(shù)，對五種致瀉大腸埃希氏菌進(jìn)行檢測。GB4789.6-2016自2017年6月23日執行以來(lái)，也是食品微生物學(xué)檢驗系列國標中，首個(gè)細菌使用PCR做確證的標準。河南省疾病預防控制中心對全省各地市進(jìn)行了質(zhì)控考核，了解各實(shí)驗室對該技術(shù)掌握的程度以及實(shí)驗室檢測水平。

　　傳統的血清學(xué)分型，操作繁瑣，技術(shù)人員要求高，且檢驗結果并不能作為是否有致病能力的依據，只能說(shuō)某個(gè)血清型可能與致病相關(guān)。血清學(xué)鑒定的137株致瀉大腸中僅有15株（10.9%）為正確鑒定，僅采用血清學(xué)分類(lèi)是不夠的[3]。與傳統血清試驗相比較而言，用PCR方法進(jìn)行確證，操作簡(jiǎn)單，對操作人員要求不高，且提高致病菌檢出率及檢驗的準確性，同時(shí)縮短了致病菌的檢驗時(shí)間。隨著(zhù)快速檢驗方法的發(fā)展，快速檢驗因其優(yōu)點(diǎn)快速發(fā)展，在突發(fā)公共衛生事件的處理中，發(fā)揮積極作用，但快速方法也存在其缺點(diǎn)，快速檢驗一般從基因著(zhù)手，檢測到致病菌并未獲得其菌株，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性結果。因此，在面對突發(fā)公共衛生事件時(shí)，應該靈活運用，將快檢方法與傳統方法相結合，快速準確地得出實(shí)驗室結果，為相關(guān)部門(mén)處理問(wèn)題提供可靠依據。該實(shí)驗室在此質(zhì)控過(guò)程中使用了兩種多重PCR方法來(lái)進(jìn)行確證試驗，相互印證結果，兩種方法實(shí)驗結果一致。實(shí)時(shí)熒光多重PCR優(yōu)點(diǎn)在于將PCR擴增與結果判定結合一起，操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，污染少。普通PCR試驗后，需要進(jìn)行電泳試驗并用凝膠成像儀觀(guān)察結果，操作繁瑣，試驗過(guò)程耗時(shí)長(cháng)，存在污染環(huán)境風(fēng)險[4]。

　　參考文獻

　　[1]李凡,劉晶星.醫學(xué)微生物學(xué)(第七版)[M].北京:人民衛生出版社,2012.

　　[2]世界衛生組織.麻疹實(shí)況報道.2017－03.

　　[3]GB4789.6-2016《食品安全國家標準食品微生物學(xué)致瀉大腸埃希氏菌菌檢驗》[s].

　　[4]JYang,FJWu,JMu,LLin,etal.ComparisonbetweenOSerotypingMethodandMultiplexReal-TimePCRToIdentifyDiarrheagenicEscherichiacoliinTaiWan[J].《JournalofClinicalMicrobiology》,2007,45(11):3620-3625

　　史曉娟魏紅霞新鄉市疾病預防控制中心

　　賀?；?emsp;新鄉市結核病防治所