材料與方法

　　菌株來(lái)源 145株金黃色葡萄球菌從食物檢測樣本中提取，其中食源性致病菌檢測樣本110株，包括熟肉、速凍制品、涼拌菜、沙拉、果汁等;食物中毒樣本35株，從患者剩余食物、糞便、肛拭子中獲得。

　　儀器試劑 Baird-Parker瓊脂培養基、血平板、亞碲酸鉀卵黃增菌液，均由北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供;溶菌酶、基因組提取試劑盒、PCR引物，由上海生工生物工程公司提供;細菌培養箱是由德國賓德公司提供;基因擴增儀、毛細管電泳儀、微量分光光度計等，是由美國IBM公司提供。

　　方法 菌株復蘇:在菌株磁珠凍存管中，用接種環(huán)挑取1顆磁珠，放于營(yíng)養瓊脂肉湯中，在37℃溫度下培養24小時(shí)，并觀(guān)察其渾濁度?；蛱崛?取混濁菌液1ml放在1.5ml的EP管內，10000rpm離心3min。除去上層清液，向沉淀物加入200μl溶菌酶溶液(濃度為50mg/ml)，混合均勻后，在37℃條件下靜置1小時(shí)。然后按照DNA提取試劑盒上的說(shuō)明提取DNA，用微量分光光度計，測定提取DNA的濃度，加純水直至濃度達到10ng/μl，并保存在-20℃的環(huán)境中。引物設計和片段測序:參考GenBank數據庫、應用Primer remier分析軟件，分別對9種腸毒素基因的PCR引物進(jìn)行篩選和設計，見(jiàn)下表1。

　　單重PCR反應體系:Multiplex PCR Mix2 25μl，上游引物、下游引物均為0.5μl;Multiplex PCR Mix1 0.25μl，模板4μl，加入純水直至50μl。擴增條件：94℃條件下預熱2min，94℃30s、54℃60s、72℃80s，共計35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸8min。經(jīng)毛細管電泳處理后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。多重PCR反應體系:對退火溫度、引物濃度等進(jìn)行調節，優(yōu)化單重PCR反應體系如下：Multiplex PCR Mix2 25μl，上游引物、下游引物均為0.4μl;Multiplex PCR Mix1 0.25μl，模板4μl，加入純水直至50μl。擴增條件設置如下：94℃條件下預熱2min;然后分別94℃30s、50℃60s、72℃80s，經(jīng)過(guò)35個(gè)循環(huán);最后72℃條件下延伸8min。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細管電泳處理，觀(guān)察結果。

　　結果

　　引物特征性驗證結果。采用盲篩法，選擇9株毛細管電泳結果出現的目的片段菌株，對PCR產(chǎn)物測序后，和GenBank數據庫進(jìn)行比對。結果顯示產(chǎn)物片段相似度高，滿(mǎn)足研究需求。見(jiàn)表2。

　　多重PCR檢測結果。利用多重PCR體系，對145株金黃色葡萄球菌的腸毒素基因進(jìn)行檢測，結果顯示97株(66.9%)至少含有1種腸毒素基因，48株(33.1%)含有2種及以上腸毒素基因。其中，9種腸毒素基因的檢出率從高到低依次為：SEU37株(25.5%)、SEG32株(22.1%)、SEM30株(20.7%)、SEK29株(20.0%)、SEQ26株(17.9%)、SEH23株(15.8%)、SEN15株(10.3%)、SEJ12株(8.3%)、SEL6株(4.1%)。金黃色葡萄球菌屬于葡萄球菌的一種，是造成食物中毒的重要原因之一，美國疾控中心的調查數據顯示，該菌株造成的食物中毒占比約為33%，僅次于大腸埃希氏菌，位居第二。對金葡的研究發(fā)現，其包含多種致病因子，例如腸毒素、殺白細胞素、溶血素、血漿凝固酶等，其中腸毒素的作用最為明顯。腸毒素是低分子蛋白和多肽，具有較強的耐熱性，即使在70-80℃條件下，30min以?xún)鹊鞍撞粫?huì )完全破壞，而且也不會(huì )被胰蛋白酶降解。針對已知的腸毒素種類(lèi)，采用有效的、特異檢測手段，能明確食物中毒的發(fā)生機制，為臨床診療提供依據。

　　本次研究中，以SEG、SHE、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN、SEQ、SEU 9種腸毒素為研究對象，建立了多重PCR檢測體系，具有操作簡(jiǎn)單、通量高、特異性高的優(yōu)點(diǎn)。結果顯示，9種腸毒素均有檢出，以SEU、SEG、SEM、SEK的檢出率高。另外，相關(guān)研究指出，SEK和SEQ之間，SEM和SEN之間，SEG和SEU之間，均存在連鎖關(guān)系。以SEK和SEQ為例，兩者位于同一株金葡菌上，可能會(huì )對金葡菌的毒性力度產(chǎn)生影響，有待進(jìn)一步研究。

　　綜上，多重PCR技術(shù)用于食源性金黃色葡萄球菌腸毒素基因檢測，準確性和特異性高，具有良好的應用價(jià)值。

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