在食品安全問(wèn)題日益多元化的今天，占人類(lèi)食品中特殊地位的乳及乳制品的安全性一直是社會(huì )和科學(xué)研究關(guān)注的焦點(diǎn)。乳制品營(yíng)養豐富、搭配均衡,是一種經(jīng)濟實(shí)惠的優(yōu)質(zhì)蛋白。我國是乳制品消費大國，也是世界第三大乳制品生產(chǎn)國。國家統計局數據顯示，我國城鎮居民家庭鮮奶人均購買(mǎi)量由1996年的4.6kg上升到2006年的18.3kg，從2007年開(kāi)始有所下降，但一直維持在14kg左右。然而，近年來(lái)頻繁發(fā)生的乳與乳制品質(zhì)量安全事件引起了人們對乳制品安全的普遍關(guān)注。乳品極易遭受致病菌污染，常見(jiàn)的污染乳制品的食源性致病菌有金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、阪崎腸桿菌等，其進(jìn)入人體內后會(huì )造成腹瀉、嘔吐、急性腸胃炎等病癥，嚴重的會(huì )危及生命。其中金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌是乳品檢測最普遍的項目。

金黃色葡萄球菌腸毒素是世界性衛生問(wèn)題，乳品尤其是原料乳極易受到金黃色葡萄球菌的污染。2009年歐洲食品安全局報道了5550例食物中毒事件，導致49000人患病、46人死亡，其中293例由金黃色葡萄球菌感染引起，是歐洲最常見(jiàn)的4種引發(fā)食物中毒的病原菌之一，由此可見(jiàn)金黃色葡萄球菌的危害極大。生乳及乳制品污染中比較常見(jiàn)的另一種食源性致病菌是沙門(mén)氏菌(Salmonella spp.)，受其感染的人和動(dòng)物會(huì )出現傷寒、副傷寒等病癥，沙門(mén)氏菌一旦進(jìn)入血液組織，則會(huì )導致系統性炎癥，甚至死亡。1994年美國暴發(fā)了由沙門(mén)氏菌導致的冰淇淋污染，約有22400人患病。

一個(gè)中等規模的乳品工廠(chǎng)，一天生產(chǎn)的不同類(lèi)產(chǎn)品至少有上百個(gè)批次，加工過(guò)程中的原料、過(guò)程品、終產(chǎn)品、生產(chǎn)環(huán)境都需要檢測金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌。GB 4789.1-2016規定同一批次需采集5個(gè)樣品進(jìn)行檢測，檢測量每天高達幾百個(gè)。根據GB 4789.4-2016和GB 4789.10-2016，沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的定性判定至少需要3d，該方法操作較繁瑣、耗時(shí)長(cháng)，不能滿(mǎn)足檢測時(shí)效的需求。由于低溫奶保質(zhì)期較短，我國正在推動(dòng)的國家優(yōu)質(zhì)乳工程，在對產(chǎn)品要求提高的同時(shí)也對檢測技術(shù)提出了新的挑戰。

本文提出的創(chuàng )新檢測體系優(yōu)化了樣品前處理過(guò)程，并引入了熒光定量PCR分子檢測技術(shù)，可以在24h內完成金黃色葡萄菌和沙門(mén)氏菌的增菌和檢測。進(jìn)行了大量驗證試驗和實(shí)際檢測后，結果表明此檢測體系穩定性好，準確性高，縮短了整體檢測時(shí)間，并降低了檢測成本，為乳品致病菌檢測技術(shù)的創(chuàng )新發(fā)展提供了研究基礎。
 
1 實(shí)驗思路
常見(jiàn)致病菌qPCR的檢測限一般在10³CFU/mL以下，而增菌后濃度一般可達10⁵CFU/mL以上，增菌后多個(gè)樣本增菌液混合提取核酸處理檢測相當于稀釋多倍（5個(gè)樣本增菌液混合相當于稀釋5倍），一般會(huì )高于檢測限，從理論上來(lái)講，采用五合一PCR檢測的方式能夠滿(mǎn)足國標方法檢測的需求。
 
2 實(shí)驗材料
2.1 樣本
樣品取自光明乳業(yè)華東中心工廠(chǎng)生產(chǎn)線(xiàn)，主要為發(fā)酵乳（包括風(fēng)味發(fā)酵乳、果味發(fā)酵乳、暢優(yōu)發(fā)酵乳、健能發(fā)酵乳、大果粒發(fā)酵乳和莫斯利安發(fā)酵乳）和部分鮮奶制品（包括無(wú)乳糖牛奶、優(yōu)倍牛奶、純牛奶與致優(yōu)全鮮乳）。
2.2 菌株
金黃色葡萄球菌陽(yáng)性菌株：ATCC27217；沙門(mén)氏菌陽(yáng)性菌株：CMCC50333。
2.3 主要試劑
金黃色葡萄球菌核酸檢測試劑盒（PCR-探針?lè )ǎ㎜R70501、沙門(mén)氏菌核酸檢測試劑盒（PCR-探針?lè )ǎ㎜R70601，購自北京良潤生物科技有限公司。
2.4 主要儀器
實(shí)時(shí)熒光PCR儀：雅睿MA-6000P；恒溫培養箱、離心機（2mL、5mL、7mL）、掌式離心機（0.2mL 8聯(lián)管）、金屬浴、渦旋混合器、移液器（10μL、100μL、1000μL）及吸頭、離心管（2mL、5mL、7mL）、PCR反應管（0.2mL）等。
 
3 實(shí)驗方法
3.1 驗證實(shí)驗
同一樣品的5次采樣為1組，其中取1~5次進(jìn)行金黃色葡萄球菌/沙門(mén)氏菌添加（10¹CFU），使用國標增菌培養基增菌后，分別取1mL混合后進(jìn)行基因組提取，5次采樣的增菌培養基按照國標方法繼續進(jìn)行后續鑒定，并記錄鑒定結果（共30組，只記錄組檢測結果）。
3.2 樣本實(shí)驗
在工廠(chǎng)進(jìn)行實(shí)際樣本（發(fā)酵乳及部分其他鮮奶制品）的檢測，采用五合一PCR的方法（同時(shí)以國標方法來(lái)做對比）記錄每組檢測結果，共1596組發(fā)酵乳、912組鮮奶制品。在前兩周的檢測中，每天都從樣品中取兩組，從中各取一份樣品進(jìn)行陽(yáng)性添加并記錄檢測結果（共30組）。
 
4 結果與分析
4.1 驗證結果分析
金黃色葡萄球菌五合一PCR驗證實(shí)驗結果表明，五合一PCR檢測與普通國標法檢測結果沒(méi)有顯著(zhù)性差異，不會(huì )出現漏檢的現象，如表1。
表1 金黃色葡萄球菌五合一PCR驗證

陽(yáng)性添加n/5*1	樣本數量	國標法陽(yáng)性*2	PCR陽(yáng)性*3
1/5	6	6	6
2/5	6	6	6
3/5	6	6	6
4/5	6	6	6
5/5	6	6	6

 
注：*1表示該樣品的5次采樣中取n次做陽(yáng)性添加；*2表示1個(gè)樣品的5次采樣按照國標法檢測，有一次為陽(yáng)性該樣品即為陽(yáng)性；*3表示1個(gè)樣品的5次采樣增菌后各取1mL混勻后進(jìn)行基因組提取檢測，結果即為樣品結果。
 
沙門(mén)氏菌五合一PCR驗證實(shí)驗結果表明，五合一PCR檢測與普通國標法檢測結果沒(méi)有顯著(zhù)性差異，不會(huì )出現漏檢的現象，如表2。
 
表2 沙門(mén)氏菌五合一PCR驗證

陽(yáng)性添加n/5*1	樣本數量	國標法陽(yáng)性*2	PCR陽(yáng)性*3
1/5	6	6	6
2/5	6	6	6
3/5	6	6	6
4/5	6	6	6
5/5	6	6	6

 
注：*1表示該樣品的5次采樣中取n次做陽(yáng)性添加；*2表示1個(gè)樣品的5次采樣按照國標法檢測，有一次為陽(yáng)性該樣品即為陽(yáng)性；*3表示1個(gè)樣品的5次采樣增菌后各取1mL混勻后進(jìn)行基因組提取檢測，結果即為樣品結果。
 
4.2 樣本實(shí)驗結果分析
在1596組發(fā)酵乳及912組鮮奶制品的金黃色葡萄球菌檢測實(shí)驗中，五合一PCR檢測與國標法檢測結果沒(méi)有顯著(zhù)性差異（國標法發(fā)酵乳金黃色葡萄球菌檢測有55組疑似陽(yáng)性，但后續驗證結果為金黃色葡萄球菌陰性；共30組樣品的陽(yáng)性添加用兩種方法檢測都為陽(yáng)性），如表3所示。
表3 金黃色葡萄球菌實(shí)際樣本檢測

樣本名稱(chēng)	樣本數量	國標疑似陽(yáng)性	國標確認陽(yáng)性	PCR陽(yáng)性
陽(yáng)性添加	30組	30	30	30
發(fā)酵乳	1596組	55	0	0
鮮奶制品	912組	0	0	0

 
在1596組發(fā)酵乳及912組鮮奶制品的沙門(mén)氏菌檢測實(shí)驗中，五合一PCR檢測與國標法檢測結果沒(méi)有顯著(zhù)性差異（國標法沙門(mén)氏菌檢測有38組疑似陽(yáng)性，但后續驗證結果為沙門(mén)氏菌陰性；共30組樣品的陽(yáng)性添加用兩種方法檢測都為陽(yáng)性），如表4所示。
表4 沙門(mén)氏菌實(shí)際樣本檢測

樣本名稱(chēng)	樣本數量	國標疑似陽(yáng)性	國標確認陽(yáng)性	PCR陽(yáng)性
陽(yáng)性添加	30組	30	30	30
發(fā)酵乳	1596組	37	0	0
鮮奶制品	912組	1	0	0

 
5 結論與展望
5.1 結論
本文探索了一種乳品中金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌快速檢測體系，采用Real-Time PCR方法，對一組樣本5次采樣的前增菌液混合后進(jìn)行基因組提取，使用金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌核酸檢測試劑盒進(jìn)行檢測，極大的縮短了檢測時(shí)間，減小了工作強度。
經(jīng)過(guò)驗證實(shí)驗以及實(shí)際樣品加標實(shí)驗，五合一PCR檢測與常規國標檢測結果上并沒(méi)有顯著(zhù)差異，不會(huì )造成漏檢。
通過(guò)對1596組發(fā)酵乳及912組鮮奶制品的應用實(shí)驗，在檢測發(fā)酵乳與鮮奶制品時(shí)，五合一PCR檢測與常規國標檢測相比，耗時(shí)更少，準確度更好，工作強度更低。

5.2 展望
目前，有研究人員探索了食品中多種致病菌的同步增菌技術(shù)，未來(lái)有希望實(shí)現由一種培養基來(lái)實(shí)現多種致病菌的同步增菌，而多重PCR也可實(shí)現多種致病菌的同時(shí)檢測，技術(shù)的發(fā)展將會(huì )使致病菌的檢測更加便捷。
近年來(lái)，國際標準化組織（ISO）已將PCR方法制定為檢測食源性致病菌的標準化方法。不久的將來(lái)，熒光定量PCR有望能夠在沙門(mén)氏菌及其他致病菌快速檢測上實(shí)現方法的標準化。建議食品檢驗方法應剝離于安全標準之外（即非強制性），給予選擇使用快速檢驗方法的合理空間。

隨著(zhù)乳制品質(zhì)量要求和營(yíng)養要求的不斷提高，對相應的檢測技術(shù)也提出了更高的要求。隨著(zhù)科技的不斷發(fā)展，乳制品中致病菌的檢測靈敏度、特異性、準確性、便捷性和及時(shí)性等方面將得到不斷的發(fā)展和改善。