按照《食品補充檢驗方法工作規定》有關(guān)規定，《食用油脂中辣椒素的測定》食品補充檢驗方法已經(jīng)國家食品藥品監督管理總局批準，現予發(fā)布。

　　特此公告。

　　食品藥品監管總局

　　2018年2月24日

　2018年第26號公告附件.doc

　　食用油脂中辣椒素的測定

　　BJS 201801

　　1 范圍

　　本方法規定了食用油脂中辣椒素(天然辣椒素、合成辣椒素、二氫辣椒素)含量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。

　　本方法適用于食用油脂中辣椒素(天然辣椒素、合成辣椒素、二氫辣椒素)含量的測定。

　　2 原理

　　試樣經(jīng)二氯甲烷溶解，氫氧化鈉水溶液提取酸化后，過(guò)固相萃取柱凈化，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測，外標法定量。

　　3 試劑和材料

　　除另行規定外，水為GB/T 6682規定的一級水。

　　3.1 試劑

　　3.1.1 乙腈(CH3CN)：色譜純。

　　3.1.2 甲醇(CH3OH)：色譜純。

　　3.1.3 甲酸(CH2O2)：質(zhì)譜級。

　　3.1.4 二氯甲烷(CH2Cl2)：色譜純。

　　3.1.5 氫氧化鈉(NaOH)：分析純。

　　3.1.6 濃硫酸(H2SO4)：98%，分析純。

　　3.2 溶液配制

　　3.2.1 0.1%甲酸水溶液：取甲酸(3.1.3)1 mL用水定容至1000 mL，用濾膜(0.22 µm，水相)過(guò)濾后備用。

　　3.2.2 0.1%甲酸乙腈溶液：取甲酸(3.1.3)1 mL用乙腈(3.1.1)定容至1000 mL,用濾膜(0.22 µm，有機相)過(guò)濾后備用。

　　3.2.3 2%氫氧化鈉溶液：稱(chēng)取20 g 氫氧化鈉(3.1.5)溶于1000 mL水中，搖勻備用。

　　3.2.4 稀硫酸(1+15)溶液：取10 mL濃硫酸(3.1.6)緩緩倒入150 mL水中，攪拌均勻備用。

　　3.3 標準品

　　天然辣椒素、合成辣椒素、二氫辣椒素標準品的中文名稱(chēng)、英文名稱(chēng)、CAS登錄號、分子式、相對分子量見(jiàn)附錄A表A.1，純度≥98%。

　　3.4 標準溶液配制

　　3.4.1 標準儲備液：分別稱(chēng)取天然辣椒素、合成辣椒素、二氫辣椒素標準品(3.3)0.1 g(精確至0.000 1 g)，用甲醇(3.1.2)溶解，并轉移至100 mL容量瓶中，定容至刻度，標準儲備液濃度為1 mg/mL。貯存于4 ℃冰箱中，有效期3個(gè)月。

　　3.4.2 混合標準系列工作液：分別準確吸取標準儲備液(3.4.1)適量于容量瓶中，用甲醇(3.1.2)將其稀釋成含量分別為0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL的標準系列混合工作液。臨用時(shí)配制。

　　3.5 C18 固相萃取(SPE)小柱：1000 mg，6 mL，或等效SPE柱。

　　4 儀器和設備

　　4.1 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-MS/MS)：配有電噴霧離子源。

　　4.2 超聲波清洗器。

　　4.3 分析天平：感量為0.000 1 g。

　　4.4 離心機：轉速≥4000 r/min。

　　4.5 渦旋混合器。

　　5 分析步驟

　　5.1 試樣制備

　　準確稱(chēng)取1 g(精確至0.000 1 g)樣品于10 mL具塞塑料試管中，加入1 mL二氯甲烷(3.1.4)，再加入3 mL 2%氫氧化鈉溶液(3.2.3)，渦旋提取10 min，4000 r/min離心10 min，取上層水相;殘留有機相再用3 mL 2%氫氧化鈉溶液重復提取一次，合并水相，再用稀硫酸溶液(3.2.4)調節pH至2-3之間后進(jìn)行固相萃取操作。C18 SPE小柱預先用3 mL乙腈淋洗3次，再用3 mL純水淋洗2次進(jìn)行活化，然后將調節完pH值的水相提取液加入小柱，控制流速至每秒1-2滴，待全部溶液通過(guò)SPE小柱后，以3 mL超純水淋洗2次，棄去流出液，最終以3 mL乙腈(3.1.1)洗脫2次。乙腈洗脫液50℃氮吹近干，用0.5 mL甲醇(3.1.2)溶解后過(guò)微孔濾膜(0.22 μm，有機相)，過(guò)濾液置于進(jìn)樣小瓶?jì)纫r管中供LC-MS/MS測定。

　　5.2 儀器參考條件

　　5.2.1 色譜條件

　　a)色譜柱：C18柱，1.8 μm，100 mm×2.1 mm(內徑)，或性能相當者;

　　b)流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液(3.2.1)，B為0.1%甲酸乙腈溶液(3.2.2)，洗脫梯度見(jiàn)表1;

　　c)流速：0.3 mL/min;

　　d)柱溫：40 ℃;

　　e)進(jìn)樣量：2 μL。

　　表1 洗脫梯度

　　時(shí)間(min)流動(dòng)相A(%)流動(dòng)相B(%)

　　08515

　　18515

　　21090

　　51090

　　5.18515

　　68515

　　5.2.2 質(zhì)譜條件

　　a)電離方式：電噴霧正離子模式;

　　b)檢測方式：多反應監測(MRM);

　　c)霧化氣壓力：30 psi;

　　d)離子噴霧電壓：4000 V;

　　e)干燥氣溫度：500 ℃;

　　f)干燥氣流速：8 L/min;

　　g)定性離子、定量離子、碎裂電壓和碰撞能量見(jiàn)表2。

　　表2 辣椒素的定性離子、定量離子、去簇電壓和碰撞能量

　　中文名稱(chēng)母離子

　　(m/z)子離子

　　(m/z)去簇電壓

　　(V)碰撞能量

　　(eV)

　　合成辣椒素294.1137.1*;170.112024/13

　　天然辣椒素306.2137.1*;182.110025/15

　　二氫辣椒素308.1137.1*;184.19019/15

　　* 指定量離子。

　　5.3 定性測定

　　按照上述條件測定試樣和混合標準工作液，如果試樣中的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間與混合標準工作液中的某種組分一致(變化范圍在±2.5%之內);且試樣中定性離子的相對豐度與濃度相當混合標準工作液的定性離子相對豐度相比，相對豐度(k)偏差不超過(guò)表3規定的范圍，則可判定為試樣中存在該組分。

　　表3 定性確證時(shí)相對離子豐度的最大允許偏差

　　相對離子豐度(%)k>50%50%≥k>20%20%≥k>10%k≤10%

　　允許的最大偏差(%)± 20± 25± 30± 50

　　5.4 定量測定

　　5.4.1 標準曲線(xiàn)的制作

　　將混合標準系列工作液(3.4.2)分別按儀器參考條件(5.2)進(jìn)行測定，得到相應的標準溶液的色譜峰面積。以混合標準工作液的濃度為橫坐標，以色譜峰的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線(xiàn)。

　　標準品液相色譜圖參見(jiàn)附錄B的圖B.1-B.3。

　　5.4.2 試樣溶液的測定

　　將試樣溶液(5.1)按儀器參考條件(5.2)進(jìn)行測定，得到相應的樣品溶液的色譜峰面積。根據標準曲線(xiàn)得到待測液中組分的濃度，平行測定次數不少于兩次;樣品中各待測組分的響應值應在標準曲線(xiàn)的線(xiàn)性響應范圍內，若超出標準曲線(xiàn)線(xiàn)性范圍，應用甲醇(3.1.2)稀釋后進(jìn)行分析。

　　6 結果計算

　　結果按式(1)計算：

　　

 

　　式中：

　　X—試樣中某種組分的含量，單位為微克每千克(μg/kg);

　　c—由標準曲線(xiàn)得出的樣液中某種組分的濃度，單位為納克每毫升(ng/mL);

　　V—試樣溶液定容體積，單位為毫升(mL);

　　m—試樣稱(chēng)取的質(zhì)量，單位為克(g);

　　計算結果以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術(shù)平均值表示,結果保留三位有效數字。

　　7 精密度

　　在重復條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。

　　8 檢出限和定量限

　　此方法的檢出限為：合成辣椒素0.05 μg/kg;天然辣椒素0.03 μg/kg;二氫辣椒素0.02 μg/kg。

　　此方法的定量限為：合成辣椒素0.2 μg/kg;天然辣椒素0.1 μg/kg;二氫辣椒素0.1 μg/kg。

　　9 判定規則

　　本方法所測定的樣品中辣椒素(合成辣椒素、天然辣椒素和二氫辣椒素)總含量大于或等于1.0 μg/kg時(shí)，該油脂樣品可能存在異常, 提示存在使用餐廚回收油脂的可能，不能僅以此結果進(jìn)行行政處罰。