□ 沃特世公司 供稿

　　氯霉素是一種價(jià)格廉宜的廣譜抗生素。氯霉素在某些易感個(gè)體中涉及毒性作用。作為致癌物質(zhì)和基因毒性化合物的可疑對象，氯霉素相關(guān)的再生障礙性貧血(骨髓抑制)致命病例已有廣泛記載。因此，在歐盟、加拿大、美國以及一些亞洲和南美國家均禁止將其用于食用性動(dòng)物、昆蟲(chóng)和水產(chǎn)養殖。歐盟委員會(huì )指令2003/181/EC規定，任何用于檢測食品中氯霉素的方法的最小性能限值(MRPL)為0.3µg/kg。

　　由于產(chǎn)品保質(zhì)期較短，需要快速的處理時(shí)間，因此乳制品檢測實(shí)驗室以往都采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)對大量樣品進(jìn)行篩查。雖然ELISA可以對氯霉素進(jìn)行靈敏而快速的篩查，但它的一個(gè)缺點(diǎn)是假陽(yáng)性結果很多，據報某些案例中的假陽(yáng)性水平達到16%。

　　免疫吸附劑與干擾基質(zhì)之間的交叉反應經(jīng)常會(huì )導致牛奶中氯霉素的誤檢，從而造成不必要的產(chǎn)品銷(xiāo)毀。質(zhì)譜檢測可以提高選擇性，有助于區分氯霉素和污染基質(zhì)。此外，質(zhì)譜檢測結合液相色譜(LC)可以避免采用氣相色譜法篩查氯霉素時(shí)所需的費時(shí)衍生化處理步驟。為了讓實(shí)驗室能夠充分利用這些優(yōu)勢，近期的技術(shù)進(jìn)展著(zhù)重于提高儀器可用性和穩定性。ACQUITY QDa檢測器易于使用，不需要專(zhuān)業(yè)的質(zhì)譜知識，因而可以方便地整合到LC工作流程中。

　　沃特世解決方案

　　Oasis®HLB;

　　ACQUITY UPLC®HSS C18色譜柱;

　　ACQUITY UPLC I-Class系統;

　　ACQUITY QDaTM檢測器。

　　應用優(yōu)勢

　　提供了一種牛奶中氯霉素的快速篩查方法。對檢測結果低于規定限值的樣品進(jìn)行定量篩查。

　　對管制抗生素進(jìn)行簡(jiǎn)單而靈敏的檢測。

　　將質(zhì)譜檢測簡(jiǎn)便應用于現有LC工作流程。

　　實(shí)驗

　　UPLC條件

　　LC：ACQUITY UPLC I-Class;

　　運行時(shí)間：5min;

　　色譜柱：ACQUITY UPLC HSS C18，1.8µm，2.1×100mm;

　　流動(dòng)相：10mM醋酸銨的45∶5甲醇/水溶液;

　　進(jìn)樣體積：10µL。

　　檢測條件

　　檢測器：ACQUITY QDa;

　　電離模式：ESI;

　　SIR通道：m/z 321.0;

　　錐孔電壓：15V;

　　探頭溫度：缺省(600℃);

　　毛細管電壓：缺省(0.8kV);

　　采樣速率：缺省(5Hz)。

　　樣品制備

　　稱(chēng)取半脫脂牛奶(5g)樣品，裝入25mL離心管中，強化至濃度達到0.3µg/kg。通過(guò)向樣品中添加己烷(5mL)和70%乙腈溶液(15mL)，完成脂肪去除和蛋白質(zhì)沉淀。振搖樣品，然后在3900G(4℃)下離心10min。去除下面的乙腈層(5mL)，然后用10%甲醇稀釋至總體積為15mL。

　　使用甲醇(2mL)和水(4mL)對Oasis HLB 3cc(60mg)小柱進(jìn)行平衡。將稀釋后的樣品(15mL)加載到小柱上，然后用5%甲醇溶液(6mL)清洗小柱。使用100%甲醇(6mL)洗脫氯霉素。隨后將洗脫液在氮氣中蒸發(fā)，用10%甲醇溶液(300µL)復溶后轉入LC-MS分析。

　　標準品制備

　　采用上述樣品制備方法制備空白牛奶樣品(未強化)。將空白基質(zhì)樣品在氮氣中干燥后，使用不同濃度的標準溶液復溶，以建立范圍相當于0.075～1µg/kg的6點(diǎn)校準曲線(xiàn)。

　　結果與討論

　　在分析牛奶提取物之前，調試氯霉素的最佳源條件，確定ACQUITY QDa檢測器的預優(yōu)化源參數可以提供最有效和最靈敏的檢測結果。氯霉素在15V錐孔電壓的負離子模式下靈敏度最高。使用上述方法，通過(guò)基質(zhì)匹配校準曲線(xiàn)可以對歐盟MRPL的強化牛奶樣品進(jìn)行準確定量。在0.075～1µg/kg的選定工作范圍內，氯霉素具有出色的線(xiàn)性(R2>0.995)，如圖1所示。

　　為了評估基質(zhì)效應，將基質(zhì)匹配校準曲線(xiàn)與相同范圍的溶劑校準曲線(xiàn)進(jìn)行比較。圖2顯示了基質(zhì)匹配和溶劑校準曲線(xiàn)的疊加圖。從該疊加圖中可以明顯看出基質(zhì)效應(離子增強)。通過(guò)統計方法也可以證實(shí)存在基質(zhì)效應，利用各校準曲線(xiàn)的斜率(樣品斜率/標準品斜率X100)，計算出基質(zhì)效應為177%。盡管存在基質(zhì)效應，使用基質(zhì)匹配校準曲線(xiàn)仍然可以對牛奶中的氯霉素實(shí)現準確的定量篩查。

　　對空白牛奶平行樣品進(jìn)行分析，未檢出假陽(yáng)性。圖3A顯示了一個(gè)空白提取樣的色譜圖示例，圖中只觀(guān)察到基線(xiàn)噪音。對于歐盟MRPL強化4個(gè)平行牛奶樣品，樣品提取后進(jìn)行重復分析(不使用價(jià)格昂貴的氘代內標)(n=8)。對照基質(zhì)匹配校準曲線(xiàn)對最終樣品進(jìn)行定量。圖3B顯示了強化濃度(0.3µg/kg)下平行樣的氯霉素峰，峰間信噪比(S/N)≥50，達到良好水平。

　　結論

　　本文開(kāi)發(fā)了一種用于定量篩查牛奶中氯霉素的準確、穩定的方法。這種方法經(jīng)證實(shí)可在無(wú)內標的情況下輕松達到法規要求的檢測水平，同時(shí)在歐盟MRPL(0.3µg/kg)水平下表現出優(yōu)異的重復性。質(zhì)譜額外的檢測區分能力提高了結果的特異性，未檢出假陽(yáng)性。