硝基呋喃類(lèi)藥物是一類(lèi)人工合成的抗生素,主要包括呋喃唑酮(furazolidone)、呋喃它酮(furaltadone)、呋喃西林(furacillin)和呋喃妥因(nitrofurantion)等，是治療畜禽胃腸道疾病的藥物或作為飼料添加劑，廣泛應用于臨床和動(dòng)物養殖業(yè)。動(dòng)物大劑量或長(cháng)期使用硝基呋喃類(lèi)藥物會(huì )引起中毒性反應，出現厭食、腹瀉、胃腸出血、周?chē)窠?jīng)炎等癥狀，甚至引發(fā)死亡。當硝基呋喃類(lèi)藥物及其代謝產(chǎn)物通過(guò)動(dòng)物性食品被人體吸收后，能在體內蓄積，導致慢性中毒，甚至致癌、致畸、致突變。由于硝基呋喃類(lèi)抗生素的代謝物在動(dòng)物組織中殘留時(shí)間較久且不易降解，所以對硝基呋喃類(lèi)藥物殘留的檢測一般通過(guò)檢測其代謝物來(lái)實(shí)現。
    國內外都對呋喃類(lèi)物質(zhì)采取了嚴格的控制手段，對其測定標準都有明確規定。2003年歐盟(EU)通過(guò)了2003/181/EC委員會(huì )決議，規定用于禽肉產(chǎn)品和水產(chǎn)品中硝基呋喃類(lèi)藥物代謝物的最小要求性能限值(Minimum Required Performance Limits，MRPL)為1μg/L。2002年，我國農業(yè)部發(fā)布的第235號公告中說(shuō)明在動(dòng)物性食品中不得檢出稍基呋喃類(lèi)藥物，并在飼養過(guò)程中禁止使用此藥物。2010年，衛生部將硝基呋喃類(lèi)藥物列入《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單》。
    目前，硝基呋喃類(lèi)藥物殘留的檢測方法主要有高效液相色譜(HPLC)、液相色譜一質(zhì)譜法(LC-MS)、液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等儀器方法及免疫檢測法(Immunoassay，IA)。隨著(zhù)我國對食品安全日益重視，檢測樣品量與日俱增，儀器分析方法因過(guò)程復雜，耗時(shí)長(cháng)而無(wú)法滿(mǎn)足大批量、快速、及時(shí)、現場(chǎng)檢測的需要。因此，開(kāi)發(fā)出簡(jiǎn)潔、快速、高靈敏、大批量、低成本的硝基呋喃類(lèi)藥物殘留快速檢測方法已成為保障食品安全的關(guān)鍵。
    酶聯(lián)免疫分析法(Enzyme Linked Immuno-sorbent Assay, ELISA)已成為近年來(lái)發(fā)展較快的免疫分析技術(shù)。其基于抗原抗體反應和酶化學(xué)反應原理，可根據顏色反應的深淺進(jìn)行定性或定量分析，特異性強、靈敏度高、重復性好、操作簡(jiǎn)單，正逐步應用于多種藥物的殘留檢測，成為當前應用最廣、發(fā)展最快的一項微量測定技術(shù)。本文主要分析酶聯(lián)免疫分析法在呋喃類(lèi)藥物殘留中的應用。
    材料與方法
    實(shí)驗材料包括雞肉、魚(yú)肉，樣本均為市售產(chǎn)品；試劑包括乙酸乙酯（分析純）、正己烷（分析純）、硫酸鋅、磷酸氫二鉀等試劑（上海華美公司）。儀器包括酶標儀（美國Thermo公司）、分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器公司）、均質(zhì)器（莆田市南榮貿易有限公司）、溫箱（天津市中環(huán)實(shí)驗電爐有限公司）、氮吹儀（美國Organomation公司）、離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)）、微量移液器（美國Thermo公司）等。
    樣品前處理過(guò)程：取1g均質(zhì)的樣品于50mL離心管中，依次加入4mL去離子水、0.5mL 1M HCl和80μL 50mM鄰硝基苯甲醛，渦動(dòng)1min至組織充分分散。衍生化16h（37℃溫箱孵育16h）后，依次加入5mL緩沖溶液、400μL 1M NaOH和6mL乙酸乙酯，劇烈渦動(dòng)1min、4000g以上離心10min。取3mL上清液于新的離心管中，50~60℃水浴中，氮氣吹干，加入1mL正己烷，再加入1mL樣品稀釋液，高速渦動(dòng)30s，離心5min，吸取下層清液500μL于干凈離心管中，并取50μL進(jìn)行檢測。
    ELISA標準曲線(xiàn)建立：取6個(gè)濃度（0、0.01、0.03、0.09、0.27、0.81μg/L）呋喃唑酮代謝物標準品，用每個(gè)濃度的標準品溶液的吸光度平均值（B）除以第一個(gè)標準品溶液（0標準）的吸光度值（B0）再乘以100％，得到百分吸光度值。對數據結果進(jìn)行分析，以標準品濃度（μg/L）的自然對數值為X軸，百分吸光度值為Y軸擬合出標準曲線(xiàn)，計算半抑制濃度（IC50）。
    樣本測定檢測操作步驟：將50μL各標準品工作液和樣品溶液分別加入對應的樣品孔中，依次加入50μL酶標記物工作液、50μL的抗體工作液；蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標板10s，充分混勻，室溫下避光反應30min。倒掉板孔中液體，加入260μL洗滌工作液，充分洗滌，加入底物混合液。避光反應后，加入50μL終止液，輕輕振蕩、混勻。用酶標儀在雙波長(cháng)450nm、630nm下檢測吸光度。
    對性能的分析：為了證明酶聯(lián)免疫試劑盒對呋喃類(lèi)藥物殘留的檢測性能，對試劑盒的靈敏度、最低檢測限、準確度、精密度進(jìn)行統計計算。同時(shí)，為了證明所用試劑盒的穩定性和準確性，分別對10份雞肉和魚(yú)肉盲樣進(jìn)行測定，與儀器分析方法結果進(jìn)行對比。儀器方法采用GB/T 20752-2006《豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品中硝基呋喃類(lèi)代謝物殘留量的測定液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法》中所述的檢測方法進(jìn)行操作。
    結果分析
    標準曲線(xiàn)的建立：
    以呋喃唑酮代謝物為例，利用維德維康數據分析軟件建立ELISA標準曲線(xiàn)（見(jiàn)圖1），標準曲線(xiàn)信息見(jiàn)表1，IC50=0.035μg/L，相關(guān)系數r=0.9978，線(xiàn)性范圍為：0~0.810μg/L，結果表明呋喃唑酮代謝物在0.01~0.810μg/L的濃度范圍內有良好的線(xiàn)性。     最低檢測限的確定：樣品的最低檢測限是靈敏度的一個(gè)評價(jià)指標。在本實(shí)驗中，分別測定了20個(gè)空白雞肉、魚(yú)肉等樣品，根據樣本檢測線(xiàn)（LOD）=20份空白樣本（平均值±標準差）+3倍標準偏差（SD），可以確定各樣本的檢測限，結果由表2~表6所示。結果表明，本試劑盒雞肉檢測限為0.098μg/L，魚(yú)肉檢測限為0.095μg/L。




    準確度和精密度的確定：準確度是指測定值與真實(shí)值的符合程度，在ELISA測定中，準確度常以回收率表示，精密度常以變異系數來(lái)表示。在本實(shí)驗中，取空白樣品，將雞肉、魚(yú)肉依次按1倍檢測限和2倍檢測限濃度呋喃唑酮代謝物標準品進(jìn)行添加，每個(gè)添加5個(gè)平行。用3個(gè)批次的試劑盒測定，計算添加回收率及板內板間變異系數，結果見(jiàn)表4~表5。經(jīng)計算得，雞肉樣品各添加濃度的回收率在87%~99.5%之間；魚(yú)肉樣品各添加濃度的回收率均在88%~100%之間。呋喃唑酮代謝物在所有樣品中各添加濃度的板內變異系數均低于5%，板間變異系數均低于10%。
    與儀器方法比較：用酶聯(lián)免疫檢測法和儀器法分別對10份雞肉、魚(yú)肉盲樣進(jìn)行測定，比較測定結果，以?xún)x器方法檢測限作為陰陽(yáng)性判定值，小于儀器檢測限試劑盒檢測結果記為“－”，儀器結果記為“ND”，大于儀器檢測限以實(shí)際檢測值表示。結果見(jiàn)表6~表7。結果顯示，二者的符合率為100%。


    討論
    本文以雞肉和魚(yú)肉的呋喃唑酮代謝物檢測為例，分析了ELISA法在肉及肉制品中硝基呋喃類(lèi)藥物快速檢測的可行性。結果表明，維德維康生物技術(shù)有限公司研制的呋喃唑酮代謝物酶聯(lián)免疫試劑盒具有較低的檢測限、較高的靈敏度和準確度，并且與儀器分析方法結果一致，說(shuō)明ELISA試劑盒能夠實(shí)現硝基呋喃類(lèi)藥物殘留的準確檢測。同時(shí)，ELISA試劑盒實(shí)驗操作簡(jiǎn)單，有效地縮減了檢測時(shí)間，提高檢測效率的同時(shí)降低了檢測成本。
    雖然具有潛在“三致”作用的硝基呋喃類(lèi)抗菌素在國內外已禁用了二十余年，但時(shí)至今日硝基呋喃類(lèi)抗菌素及其代謝物 殘留仍時(shí)有檢出。因此，開(kāi)發(fā)出簡(jiǎn)潔、快速、高靈敏、大批量、低成本的硝基呋喃類(lèi)藥物殘留快速檢測方法已成為保障食品安全的關(guān)鍵，而ELISA試劑盒的強特異性、及時(shí)性、低成本能夠有效地填補硝基呋喃類(lèi)藥物殘留快速檢測的空白，有力地推動(dòng)我國食品安全快速檢測技術(shù)的發(fā)展。