近年來(lái)，由食源性致病菌引發(fā)的食物中毒不斷發(fā)生，1996年日本發(fā)生了世界上規模最大的歷時(shí)3個(gè)月、波及40多個(gè)都府縣、涉及上萬(wàn)人的大腸桿菌O157食物中毒事件;2001年因發(fā)生“瘋牛病”導致德國衛生部部長(cháng)和農業(yè)部部長(cháng)辭職;2005年遍及整個(gè)東南亞的禽流感更為各國的食品安全部門(mén)敲響警鐘;2011美國23個(gè)州爆發(fā)了活禽引發(fā)的沙門(mén)氏菌疫情，造成將近100人感染;我國也爆發(fā)過(guò)多起由食源性致病菌引起的食物中毒事件，其中1999年爆發(fā)的大腸桿菌O157:H7中毒事件，中毒人數達2萬(wàn)，其中死亡177人，給我國經(jīng)濟造成了巨大損失。

　　食品安全已成為世界各國共同面臨和關(guān)注的問(wèn)題，由病原微生物引起的食源性疾病是影響食品安全最主要的因素之一?？焖俣鴾蚀_地檢測出被稱(chēng)為“頭號殺手”的食品致病菌，是確保食品安全的首要任務(wù)，因此建立一種快速、準確、便捷的檢測技術(shù)，對于從源頭制止食源性致病菌污染，預防中毒事件的發(fā)生具有重要意義。食源性致病菌的傳統檢測方法主要有微生物培養法、電阻電導測定法、細菌直接計數法、分子生物學(xué)法、免疫學(xué)方法等。但傳統微生物檢驗方法，不僅步驟復雜，而且耗時(shí)費力、靈敏度也不高，難以吸水紙上，拍干;

　　g.立即在每孔中加入底物混合液，蓋好蓋板膜，輕輕振蕩混勻，室溫下避光反應;

　　h.揭開(kāi)蓋板膜，在每孔中加入終止液，輕輕振蕩混勻;

　　i.終止后5min內用酶標儀取吸光度值。

　　該試劑盒靈敏度0.04ppb，原奶樣本檢測限為0.1ppb，奶粉檢測限為0.5ppb，樣品回收率范圍90%±30%。

　　黃曲霉毒素M1快速檢測試紙條

　　試紙條將特異性的抗原以條帶狀固定在膜上，金標抗體吸附在微孔中，待檢樣本溶解微孔的金標抗體后通過(guò)毛細作用向前移動(dòng)至固定抗原區域時(shí)，待檢物與金標抗體的結合物又與之發(fā)生特異性結合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過(guò)肉眼觀(guān)察到顯色結果。

　　設備：溫育器;微量移液器。

　　檢測步驟：

　　a.將待檢奶樣和產(chǎn)品組分恢復至室溫;

　　b.打開(kāi)鋁箔袋，取所需量金標微孔和試紙條;

　　c.待檢奶樣充分搖勻后加入金標微孔中，置于50℃溫育器中溫育;

　　d.將試紙條插入金標微孔中反應;

　　e.從金標微孔中取出試紙條，去試紙條下端的樣品墊，判定結果。

　　結果判定：

　　陰性：T線(xiàn)比C線(xiàn)顏色深或者一致，檢測結果為陰性。

　　陽(yáng)性：T線(xiàn)比C線(xiàn)顏色淺或者沒(méi)有顏色，檢測結果為陽(yáng)性。

　　無(wú)效：C線(xiàn)不顯色，無(wú)論T線(xiàn)是否顯色，該試紙條均判為無(wú)效。

　　該試紙條對原奶和奶粉檢測限均為0.2ppb。

　　黃曲霉毒素M1膠體金檢測試紙條具有靈敏度高、特異性強、快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟、穩定性好等優(yōu)點(diǎn)?？梢詽M(mǎn)足大量試樣篩選的需要，可以在小型和現場(chǎng)實(shí)驗室進(jìn)行，在商檢、衛檢等基層容易普及。

　　適應飛速發(fā)展的現代食品生產(chǎn)要求。上轉發(fā)光技術(shù)是一種新的檢測方法，具有簡(jiǎn)便、快速、廉價(jià)、適應性廣等優(yōu)點(diǎn)，可用于基層單位中各種食源致病菌的快速篩查檢測。

　　食品中病原微生物快速檢測

　　技術(shù)常用方法及其優(yōu)缺點(diǎn)

　　食品微生物快速檢驗方法的研究始于上世紀80年代早期,隨著(zhù)食源性疾病發(fā)病人數顯著(zhù)增加,即使在發(fā)達國家,食源性疾病也呈上升趨勢，各國也越來(lái)越重視此項工作。近年來(lái),人們采用免疫學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等先進(jìn)技術(shù)進(jìn)行快速檢驗方法的研究，使其發(fā)展更為迅速。傳統的食源性病原微生物的檢測、鑒定仍停留在分離培養、形態(tài)觀(guān)察、生化鑒定和血清學(xué)分型等水平，存在操作煩瑣、檢測周期較長(cháng)、檢測結果往往存在不同程度滯后等缺點(diǎn)，這不僅不利于食品安全管理體系及時(shí)驗證控制措施實(shí)施效果，也不利于對潛在不安全產(chǎn)品迅速采取糾正措施。對食源性致病菌進(jìn)行準確、靈敏、省時(shí)、省力和省成本的快速檢驗方法已經(jīng)成為保證食品安全的迫切需求，從長(cháng)遠發(fā)展趨勢來(lái)說(shuō)，快速方法是微生物檢測的一大方向。上世紀50年代以來(lái)，國內外學(xué)者進(jìn)行了大量的研究，從以傳統方法為基礎發(fā)展到以免疫學(xué)(如ELISA及免疫層析試紙條法)為基礎或以分子生物學(xué)法(如常規PCR及熒光定量PCR方法)為基礎的快速檢驗方法，并在實(shí)踐檢驗中不斷取得新進(jìn)展。ATP法、免疫法、和顯色培養基法在國外應用相當成功，國內的許多檢測機構也在使用或正在考慮使用國外先進(jìn)的快速檢測技術(shù)，如紙片法、生物化學(xué)技術(shù)(如PCR技術(shù)和基因探針技術(shù)等)、選擇鑒定用培養基法、免疫學(xué)技術(shù)、細菌直接計數法、全自動(dòng)微生物分析系統(AMS)等。但這些方法中有些要求配備特殊的儀器，有些需要操作人員具有較高的技術(shù)水平，還有些財政和人力投入較大，因此絕大部分微生物快檢方法在基層單位暫時(shí)無(wú)法推廣應用。目前應用于微生物檢測的常用方法及其優(yōu)缺點(diǎn)見(jiàn)表1 。

　　上轉發(fā)光技術(shù)

　　上轉發(fā)光技術(shù)(up-converting phosphor technology，UPT)是基于上轉發(fā)光材料(up-converting phosphor，UCP)而發(fā)展起來(lái)的一種新型標記技術(shù)，UCP是由幾種稀土金屬元素摻雜于某些晶體的晶格中構成的納米級顆粒。由于獨特的結構，UCP可由紅外光激發(fā)而發(fā)射可見(jiàn)光——上轉發(fā)光(up-converting)。這種絕無(wú)僅有的性質(zhì)使UCP作為標記物在生物分析中，以無(wú)本底干擾、無(wú)焠滅、適于多重分析和定量分析等具有顯著(zhù)優(yōu)勢，從本質(zhì)上有別于傳統標記物。因此一種叫做上轉換發(fā)光顆粒免疫層析(UPT-LF)的檢測技術(shù)應運而生，因其具有對樣品種類(lèi)的耐受程度高，不受操作環(huán)境、技術(shù)人員及設備的限制，操作過(guò)程簡(jiǎn)單快速的同時(shí)能夠得到多重定量結果等諸多優(yōu)點(diǎn)逐漸發(fā)展起來(lái)。

　　上轉發(fā)光技術(shù)檢測原理

　　UCP包括3種主要成分：主基質(zhì)、吸收子和發(fā)射子，由于其獨特的結構,可以出現反Stokes現象,即這種材料可在紅外光區(波長(cháng)>780nm)被激發(fā),卻發(fā)射波長(cháng)遠短于激發(fā)光的可見(jiàn)光(波長(cháng)為475～670nm),這一現象在自然界中并不存在,其基本原理是雙光子或多光子熒光,即能量上轉。選擇不同的吸收子、發(fā)射子和主基質(zhì)可使UCP具有不同的光學(xué)性質(zhì),成為其使用靈活的基礎。

　　上轉發(fā)光技術(shù)與經(jīng)典的免疫層析技術(shù)相結合，采用新型標記物——UCP上轉發(fā)光材料，通過(guò)掃描分析光電信號，實(shí)現對目標抗原或抗體的現場(chǎng)快速檢測。上轉發(fā)光技術(shù)試紙條是由UPT與免疫層析共同組成，主要由試紙條以下5個(gè)部分組成：樣品墊、結合墊又稱(chēng)結合物稀釋墊、分析膜、吸水墊、粘性底襯。疊合順序如圖1所示，通過(guò)粘膠固定于粘性底襯上。

　　各部分的作用分別為：樣品墊是滴加被檢樣品的部位;結合墊中含有標記物-生物活性分子結合物，在加入被檢樣品后，其可在試紙條上發(fā)生免疫反應;分析膜是免疫反應發(fā)生的部位，因此是層析試紙的核心結構，抗原、抗體等生物活性分子均固定其上作為檢測帶和質(zhì)控帶;吸水墊的虹吸作用為整個(gè)反應過(guò)程中的液流提供動(dòng)力。為保證液體在試紙條上流動(dòng)的連續性，各個(gè)部分之間需要有一定的重疊區。

　　檢測時(shí)，首先將待檢樣品滴加到樣品墊上，樣品通過(guò)滲透與虹吸作用進(jìn)入結合墊，使其中固定的標記物——生物活性分子結合物重新解離，并在吸水墊的虹吸作用下，離開(kāi)結合墊流入分析膜，向吸水墊的方向流動(dòng)。此過(guò)程中標記物——生物活性分子結合物、目標被檢物與檢測帶、質(zhì)控帶之間將發(fā)生一定的特異性免疫反應，并通過(guò)具有指示性的標記物產(chǎn)生反應信號。依據所發(fā)生的免疫反應方式的不同，可分為夾心模式與競爭模式。

　　上轉發(fā)光技術(shù)發(fā)展的歷程

　　UCP作為生物標記物所具有的獨特優(yōu)勢在1995年便已引起了美國軍方的重視，在國防部下屬DARPA(Defense Advanced Research Projects Agency)的大力支持之下，開(kāi)發(fā)了基于上轉換發(fā)光技術(shù)的手持式傳感器以及流式細胞儀(如圖2)，用于對戰場(chǎng)上可能使用的多種生物戰劑進(jìn)行快速的預警與鑒定。

　　國內得益于我國稀土資源豐富，研究單位包括軍事醫學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所楊瑞馥實(shí)驗室、北京熱景生物技術(shù)公司，在2000年已經(jīng)完成了UCP顆粒的制備，而且在顆粒上有了一定的突破;2002年創(chuàng )造了以UCP為基礎的自主研制PCT;2003年，研制出了第一代UPT免疫分析儀;2005年研制出了第三代便攜式系統，應用于國家安全、部隊、疾控生物戰劑檢測，在生物應急領(lǐng)域，研制完成的UPT快速檢測系統(UPT生物傳感器及UPT免疫層析試紙)可檢測鼠疫菌、炭疽芽孢、布魯氏菌、抗鼠疫菌抗體、抗SARS-CoV抗體、霍亂O1菌、霍亂O139菌等多種病原體，已推廣多個(gè)地方疾控系統——北京市衛生局、中國檢驗檢疫科學(xué)研究院、防化研究院、鼠疫防治系統等職能單位;2008年，UPT系統已經(jīng)實(shí)現了產(chǎn)業(yè)化;2011年獲得國內第一個(gè)自主知識產(chǎn)權現場(chǎng)檢測技術(shù)生產(chǎn)文號，并獲得了完整的工藝流程與系統產(chǎn)品，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了面向臨床、生物反恐、食品安全快速檢測儀器及試劑，總共獲得12個(gè)產(chǎn)品批準文號，該系列產(chǎn)品打破了國外技術(shù)的壟斷，項目產(chǎn)品已經(jīng)用于臨床檢測、軍隊和地方生物反恐、食源性致病菌檢測等;2014年該項目獲得中華醫學(xué)會(huì )二等獎、北京市科技進(jìn)步二等獎。

　　上轉發(fā)光技術(shù)在微生物領(lǐng)域的應用

　　UCP獨有的上轉發(fā)光現象決定了它不存在背景干擾，Niedbala等(2001)報道了上轉磷光技術(shù)已被應用于免疫標記分析，UCP作為標記物的免疫層析技術(shù)，它不僅克服了膠體金免疫層析只能定性而不能定量的缺陷，更以其適用于多重分析、無(wú)背景吸收、無(wú)焠滅等特點(diǎn)，賦予了免疫層析技術(shù)新的特性。2001年有學(xué)者報道，用上轉換熒光橫向流檢測特定核酸氨基酸序列是一種快速，靈敏的檢測DNA方法，可以識別人類(lèi)乳頭狀瘤病毒16種類(lèi)型的感染。Zuiderwijk M等(2003)報道了用雙抗體夾心免疫層析法，在上轉換熒光免疫技術(shù)和橫向流動(dòng)技術(shù)的基礎上，可檢測病原體鏈球菌，檢測結果顯示，只需要1ng DNA即可檢測出肺炎鏈球菌，表明了UPT技術(shù)在傳染病領(lǐng)域的應用潛力。Zhongqiang Y,Lei Z等在2006年研究開(kāi)發(fā)了基于側向流免疫上轉換UPT技術(shù)的生物傳感器，這種生物傳感器已經(jīng)被開(kāi)發(fā)并用于快速定量檢測鼠疫耶爾森氏菌，研究原理是用納米級的UCP顆粒作為標記物，采用夾心免疫層析法，在UPT——LF免疫分析系統的平臺上進(jìn)行檢測，從樣品處理到數據結果分析不到30分鐘。Vijaya等(2007)，應用上轉發(fā)光法快速檢測呼吸道合胞病毒感染,此檢測設備運用新型上轉磷光技術(shù)，也是上轉磷光技術(shù)第一次用于傳染性疾病的檢測，此設備設計便攜,

　　可以直觀(guān)的判定呼吸道合胞病毒(RSV)感染檢測,此種方法的臨床檢測靈敏度為90%，特異性為98.3%，與經(jīng)過(guò)RT-PCR驗證的病毒培養相比較，相關(guān)系數達到96.2%。Corstjens等(2008)，用UCP作為標記的層析流技術(shù)檢測T細胞分泌的γ-干擾素，其分析靈敏度>2pg/mL。

　　上轉發(fā)光技術(shù)在食品中病原微生物檢測的應用

　　據WHO估計，由于全球性食品貿易的快速增長(cháng)以及人口的流動(dòng)，飲食習慣的改變，新食源性致病菌不斷出現，全世界每年發(fā)生食源性疾病數10億人，每年約有200萬(wàn)兒童死于腹瀉，其中66%以上是由細菌性致病菌所致。

　　食源性致病菌導致的疾病是食品安全的關(guān)鍵問(wèn)題，其中動(dòng)物源性食品中沙門(mén)氏菌、大腸桿菌O157、霍亂弧菌、副溶血弧菌等引起的食源性疾病是食品安全的主要問(wèn)題。UCP作為標記物的免疫層析技術(shù)，它不僅克服了膠體金免疫層析只能定性而不能定量的缺陷，更以它適用于多重分析、無(wú)背景吸收、無(wú)焠滅等特點(diǎn)，賦予了免疫層析技術(shù)新的特性。傳統的橫向流方法通常用有色顆粒標記，像膠體金或著(zhù)色，通過(guò)顏色識別結果，然而，定性以及較低的靈敏度限制了其檢測應用，而UCP顆粒在最低檢測線(xiàn)下仍然可以檢測，用基于橫向流的上轉發(fā)光技術(shù)分析，可以在109CFU/mL的微生物環(huán)境下檢測到103CFU/mL的大腸桿菌O157:H7，濃度變異系數在0～107organism/mL之間均<10%，對于較小的微生物，最低檢測線(xiàn)在5ng/mL以下。而且，此技術(shù)可以進(jìn)行多重檢測，可同時(shí)進(jìn)行多靶標檢測。研究發(fā)現，使用上轉發(fā)光免疫層析試紙盒可對包括乙型副傷寒沙門(mén)氏菌、霍亂弧菌O1、O139群、大腸桿菌O157、甲型副傷寒沙門(mén)氏菌、腸炎沙門(mén)氏菌、豬霍亂沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌、傷寒沙門(mén)氏菌和丙型副傷寒沙門(mén)氏菌在內的10種食源性致病菌進(jìn)行檢測，不增菌檢測敏感性為109～105CFU/mL，增菌敏感性<10CFU/mL。均可滿(mǎn)足食物樣本增菌檢測和腹瀉樣本直接檢測的靈敏度需求。線(xiàn)性擬合系數R2介于0.9～0.98之間，均具有良好的定量能力。每種試紙與其它9種菌之間無(wú)明顯交叉反應，特異性良好。

　　上轉發(fā)光技術(shù)在食品中病原微生物檢測的應用前景

　　李斯特氏菌、沙門(mén)氏菌和大腸桿菌等食品致病菌，已經(jīng)成為威脅食品安全的頭號殺手，快速而準確檢測出被稱(chēng)為“頭號殺手”的食品致病菌，是確保食品安全的首要任務(wù)，UCP作為標記物的免疫層析技術(shù)，它不僅克服了膠體金免疫層析只能定性而不能定量的缺陷，更以它適用于多重分析、無(wú)背景吸收、無(wú)焠滅等特點(diǎn)，確保了在檢測過(guò)程中高度的敏感性、穩定性、安全性，賦予了免疫層析技術(shù)新的特性。同時(shí)上轉發(fā)光技術(shù)的UCP顆粒因其具有對樣品種類(lèi)的耐受程度高，不受操作環(huán)境、技術(shù)人員及設備的限制，操作過(guò)程簡(jiǎn)單快速的同時(shí)能夠得到多重定量結果等諸多優(yōu)點(diǎn)逐漸發(fā)展起來(lái)，可以廣泛應用于國內基層單位對食源性致病菌現場(chǎng)快速檢測及診斷。隨著(zhù)對UCP研究的不斷深入，上轉發(fā)光技術(shù)在食品中病原微生物檢測的經(jīng)濟價(jià)值、產(chǎn)業(yè)需求以及發(fā)展前景將不可限量。