劉勝桃，宋 鴿，王秀艷，李慧娟，常建軍，王 宏

(蒙牛乳業(yè)(沈陽(yáng))有限責任公司，遼寧沈陽(yáng) 110122)

摘 要：目的：研究一種可行、適用、準確的霉菌檢測培養方法，來(lái)解決培養過(guò)程中培養基干裂、環(huán)境污染、菌落計數不準確的問(wèn)題。方法：對膜包裹法、培養盒法、直接培養法3種方法進(jìn)行比較，來(lái)評價(jià)3種方法的可行性、適用性和準確性。結果：采用直接培養法培養的空白和樣品出現較大程度的污染及干裂現象，膜包裹法、培養盒法培養的樣品未造成污染，培養基未干裂不影響菌落計數。結論：采用隔離的方法能夠有效控制培養基干裂和污染的問(wèn)題，提高菌落計數的準確性，同時(shí)可避免霉菌孢子在培養、觀(guān)察過(guò)程中擴散到環(huán)境中，造成污染，培養盒法較膜包裹法更方便、快捷、易觀(guān)察，是實(shí)驗室值得推廣的培養方法。

關(guān)鍵詞：霉菌;污染;干裂;隔離;培養

霉菌是絲狀真菌的統稱(chēng)，廣泛分布于土壤、水、空氣等自然環(huán)境中[1-3]，因此食品極易被霉菌污染[4]。霉菌可引起食品、農產(chǎn)品的發(fā)霉變質(zhì)，霉菌毒素可導致慢性中毒具有致癌、致畸、致突變作用[5]，可對人體健康造成危害[6-12]。霉菌的監測也成為食品檢驗技術(shù)與食品衛生質(zhì)量評價(jià)中的重要組成部分[13-16]，我國先后5次修訂了食品中霉菌計數的方法標準[17-21]，據此我國各級監督檢測機構全面開(kāi)展食品中霉菌的檢測工作，自《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母菌計數》(GB 4789.15—2016)實(shí)施以來(lái)將原標準中倒置平板培養改成正置平板培養，霉菌培養中的污染和培養基干裂現象頻發(fā)，這主要是因為霉菌菌落可產(chǎn)生數量巨大的孢子，同時(shí)霉菌的孢子具有小、輕、干、多、休眠期長(cháng)和抗逆性強等特點(diǎn)，任何一個(gè)孢子在適宜條件下都能發(fā)展成新的個(gè)體。常規霉菌檢測的培養過(guò)程中，以及觀(guān)察移動(dòng)過(guò)程中，不可避免地造成空氣流動(dòng)，霉菌孢子可趁機飄散進(jìn)入空氣中并隨處散播、繁殖，引起嚴重的交叉污染和外部侵染[22]。又因霉菌的培養時(shí)間較長(cháng)，培養基在培養過(guò)程中水分損失較大，即使加大了培養基的傾注量，也無(wú)法避免培養基干裂，從而導致影響菌落計數的問(wèn)題，而目前這兩項常見(jiàn)且棘手的問(wèn)題始終困擾著(zhù)相關(guān)人員，且無(wú)有效的控制

措施。

本實(shí)驗室在日常霉菌檢測中采取兩種隔離培養方法，即膜包裹法、培養盒法，對霉菌孢子擴散、污染及培養基干裂的控制效果顯著(zhù)，且成本低廉，操作簡(jiǎn)便，對比《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數》(GB 4789.15—2016)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)國標法)的計數結果，探討霉菌檢測過(guò)程中隔離式培養方法的可行性、實(shí)用性和準確性[23-27]。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

1.1.1　樣品來(lái)源

霉菌和酵母質(zhì)控樣(QC-FD-020)，來(lái)自中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價(jià)中心;霉菌和酵母質(zhì)控樣(A062018M)，來(lái)自北京美正檢測技術(shù)有限公司。

1.1.2　試劑

孟加拉紅瓊脂，CM164，北京陸橋技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.1.3　耗材

霉菌培養盒，食品級PVC材質(zhì)，分為4個(gè)凹槽，凹槽與培養皿直徑及高度相匹配，每個(gè)凹槽有3個(gè)透氣孔，培養過(guò)程中形成有氧培養環(huán)境，此裝置為一次性使用，計數后的培養皿連同裝置一同高壓滅菌處理即可;保鮮膜或封口膜。

1.2　儀器與設備

BSC-1300IIB2生物安全柜(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫療設備廠(chǎng));SSW-600-2S恒溫水箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫療設備廠(chǎng));MJX-250BⅢ霉菌培養箱(天津市泰斯特儀器有限公司);MSⅢ basic漩渦混合器(德國IKA)。

1.3　實(shí)驗方法

1.3.1　膜包裹培養法

稱(chēng)取25 g樣品加入225 mL無(wú)菌生理鹽水中，充分振搖，制成1∶10樣品勻液，取1∶10樣品勻液1 mL，加入含有9 mL無(wú)菌生理鹽水的試管中，旋渦混勻，制成1∶100的樣品勻液，同時(shí)做空白對照，及時(shí)傾注冷卻至46 ℃的孟加拉紅培養基，待瓊脂凝固后，在潔凈室中將平皿4～6個(gè)疊放，外層包裹保鮮膜或封口膜，在疊放的皿與皿之間用刀劃上長(cháng)約2 cm的透氣孔，每層劃2～3個(gè)透氣孔，正置平板，置(28±1)℃培養箱中培養，同時(shí)以直接培養法的樣品作為對照，觀(guān)察并記錄培養至第5 d的結果。

1.3.2　霉菌盒培養法

稱(chēng)取25 g樣品加入225 mL無(wú)菌生理鹽水中，充分振搖，制成1∶10樣品勻液，取1∶10樣品勻液1 mL，加入含有9 mL無(wú)菌生理鹽水的試管中，旋渦混勻，制成1∶100的樣品勻液，同時(shí)做空白對照，及時(shí)傾注冷卻至46 ℃的孟加拉紅培養基，待瓊脂凝固后將平皿正置于霉菌盒中，每個(gè)槽可放置一個(gè)培養皿，將上蓋蓋嚴即可放入(28±1)℃培養箱培養，同時(shí)以直接培養法的樣品做對照，觀(guān)察并記錄培養至第5 d的結果。

1.3.3　直接培養法

稱(chēng)取25 g樣品加入225 mL無(wú)菌生理鹽水中，充分振搖，制成1∶10樣品勻液，取1∶10樣品勻液1 mL，加入含有9 mL無(wú)菌生理鹽水的試管中，旋渦混勻，制成1∶100的樣品勻液，同時(shí)做空白對照，及時(shí)傾注冷卻至46 ℃的孟加拉紅培養基，待瓊脂凝固后，正置平板，置(28±1)℃培養箱中培養，同時(shí)以直接培養法的樣品作對照，觀(guān)察并記錄培養至第5 d的結果。

2　結果與分析

2.1　膜包裹培養法、霉菌盒培養法與直接培養法結果比較

對8組不同類(lèi)型的樣品(已知不含菌樣品)進(jìn)行霉菌檢測，同時(shí)監控5組空白實(shí)驗，每組樣品每個(gè)稀釋度均進(jìn)行兩組平行檢測，用膜包裹培養法和霉菌盒裝置培養的8組實(shí)驗樣品及5組空白對照，均未出現污染、培養基干裂的情況，同時(shí)使用菌片法進(jìn)行檢驗驗證結果一致。而采用直接法培養的13組樣品，10組樣品出現不同程度的污染，部分培養基干裂，樣品污染情況占比69%，培養基干裂數量占比77%。

實(shí)驗結果表明，膜包裹培養法和霉菌盒裝置培養法均可將環(huán)境中的污染來(lái)源完全隔離，且可以保證在較長(cháng)的培養時(shí)間內降低培養基水分的損失。但霉菌盒裝置在結果觀(guān)察過(guò)程無(wú)需打開(kāi)培養盒，可直接透過(guò)培養盒清晰地對菌落進(jìn)行觀(guān)察計數，達到從樣品培養到出具結果，最終到廢棄物處理環(huán)節，培養物與外界環(huán)境始終保證有效的隔離，避免了環(huán)境、樣品、人員相互污染的風(fēng)險。膜包裹培養法、霉菌盒正置培養法與直接法培養結果如表1所示。

2.2　膜包裹培養法、霉菌盒培養法準確性測試

使用膜包裹培養法及霉菌盒培養法對6組不同特性區間及不同廠(chǎng)家的霉菌質(zhì)控樣品進(jìn)行檢測，每組樣品、每個(gè)稀釋度均進(jìn)行兩組平行檢測，檢測結果均在質(zhì)控樣品特性區間，將膜包裹培養法得到的結果與霉菌盒培養法得到的結果配對檢驗，p=0.18>0.05，表明無(wú)顯著(zhù)性差異;培養過(guò)程中未出現培養基干裂及污染的現象，空白對照均無(wú)菌落生長(cháng)，證明了兩種隔離培養方式不會(huì )對霉菌的生長(cháng)產(chǎn)生影響，如表2所示。

3　結論與討論

本研究通過(guò)對膜包裹法、霉菌盒培養法、直接培養法培養過(guò)程進(jìn)行比較，發(fā)現膜包裹法、霉菌盒培養法可有效解決在培養過(guò)程中水分流失造成的培養基干裂問(wèn)題，且無(wú)污染，同時(shí)對質(zhì)控樣品檢測發(fā)現上述兩種隔離培養方式不影響菌落計數，不影響霉菌的生長(cháng)。因膜包裹法觀(guān)察過(guò)程中需要將膜拆開(kāi)，而霉菌盒培養法較膜包裹法的優(yōu)勢在于在觀(guān)察和計數過(guò)程中不需要打開(kāi)霉菌盒裝置，透過(guò)裝置可清晰對菌落進(jìn)行觀(guān)察計數，從平板培養到最終廢棄物處置，培養物與外界環(huán)境始終保證有效的隔離措施，避免了環(huán)境、樣品、人員相互污染的風(fēng)險。操作方便、成本低廉，霉菌培養盒也可應用于培養時(shí)間較長(cháng)和(或)溫度較高的微生物檢測項目，例如嗜熱需氧芽孢檢測等，是實(shí)驗室值得推廣的培養方法。

參考文獻

[1]WANG X,WU Q H,WAN D,et al.Fumonisins: oxidative stress-mediated toxicity and metabolism in vivo and in vitro[J].Archives of Toxicology,2016,90(1):81-101.

[2]BHAT R,REDDY K R N.Challenges and issues concerning mycotoxins contamination in oil seeds and their edible oils: Updates from last decade[J].Food Chemistry,2017,215:425-437.

[3]侯佳琪,王璐,何苗,等.糕點(diǎn)中霉菌的檢驗和控制[J].食品安全導刊,2017(24):93.

[4]韓濤,楊雪妮,張芳.霉菌檢測中封閉式培養方法的建立和應用[J].食品科學(xué),2019,40(16):308-313.

[5]張晨夕,韓陽(yáng),陳丹丹.紙張中霉菌檢測方法研究[J].黑龍江造紙,2019(2):18-24.

[6]董曼佳,楊其亞,孫偉,等.拮抗酵母菌控制玉米赤霉烯酮的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2016,37(1):230-234.

[7]LIN P F,CHEN F L,SUN J,et al.Mycotoxin zearalenone induces apoptosis in mouse Leydig cells via an endoplasmic reticulum stress-dependent signalling pathway[J].Reproductive toxicology,2015,52:71-77.

[8]GAO W,JIANG L P,GE L,et al.Sterigmatocystin-induced oxidative DNA damage in human liver-derived cell line through lysosomal damage[J].Toxicology in vitro,2015,29(1):1-7.

[9]MCKEAGUE M,BRADLEY C R,DE GIROLAMO A,et al.Screening and initial binding assessment of fumonisin B1 aptamers[J].International Journal of Molecular Sciences,2010,11(12):4864-4881.

[10]IQBAL S Z,JINAP S,PIROUZ A A,et al.Aflatoxin M1 in milk and dairy products, occurrence and recent challenges: a review[J].Trends in Food Science & Technology,2015,29(1):1-7.

[11]CARVAJAL-MORENO M.Metabolic changes of aflatoxin B1 to become an active carcinogen and the control of this toxin[J].Immunome Research,2015,11(3):2-14.

[12]SELVARAJ J N,WANG Y,ZHOU L,et al.Recent mycotoxin survey data and advanced mycotoxin detection techniques reported from China: a review.[J].Food Additives and Contaminants-Part A Chemistry,Analysis,Control,Exposure and Risk Assessment,2015,32(4):440-452.

[13]韋尚偉.食品檢驗技術(shù)中存在的問(wèn)題[J].現代食品,2017(5):61-63.

[14]鄒軍.我國食品檢驗技術(shù)中存在問(wèn)題及解決方法探析[J].科技創(chuàng )新與應用,2016(8):297.

[15]陳平燕.我國食品檢驗技術(shù)中存在的問(wèn)題探析[J].廣東蠶業(yè),2017,51(10):94-95.

[16]高景會(huì ).食品安全檢測中存在的問(wèn)題及解決對策[J].現代食品,2017(8):12-13.

[17]中華人民共和國衛生部.食品衛生微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母數測定:GB/T 4789.15—1984[S].北京:中國標準出版社,1984.

[18]中華人民共和國衛生部.食品衛生微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母數計數:GB/T 4789.15—1994[S].北京:中國標準出版社,1994.

[19]中華人民共和國衛生部.食品衛生微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母數計數:GB/T 4789.15—2003[S].北京:中國標準出版社,2003.

[20]中華人民共和國衛生部.食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數:GB 4789.15—2010[S].北京:中國標準出版社,2010.

[21]國家衛生和計劃生育委員會(huì ).食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數:GB 4789.15—2016[S].北京:中國標準出版社,2016.

[22]劉永永,紀丹,劉曉海,等.生化培養箱內部的循環(huán)風(fēng)向對霉菌檢測結果的影響[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報,2020,11(1):262-268.

[23]李若旦才讓.提高食品檢驗準確性的措施[J].食品安全導刊,2016(18):33.

[24]陳創(chuàng )輝.食品檢驗結果的影響因素及提高檢驗結果準確性的措施[J].食品安全導刊,2018(18):57.

[25]陳杰.科學(xué)做好食品安全檢驗檢測工作[J].中國食品,2018(6):68-70.

[26]徐慧萍,李翠霞.我國乳品質(zhì)量安全的影響因素分析[J].中國食物與營(yíng)養,2012,18(8):5-8.

[27]郭利亞,王加啟,李發(fā)弟.淺析我國生鮮乳質(zhì)量安全監管及對策[J].中國畜牧雜志,2012,48(12):42-45.