魏姣姣，黃喜海

(浙江華才檢測技術(shù)有限公司，浙江諸暨 311800)

摘 要：由于食品表面非目標源的干擾，食品微生物污染檢測的結果存在一定偏差，為此，本文提出一種基于A(yíng)TP生物熒光增幅法的食品微生物污染檢測方法，利用微生物的繁殖特性，將營(yíng)養物質(zhì)進(jìn)行熒光標記，通過(guò)統計顯微環(huán)境下熒光ATP的增幅，判定檢測食品中是否存在微生物，避免直接統計受到的干擾，以此實(shí)現對食品微生物污染的有效檢測。

關(guān)鍵詞：微生物污染;微生物檢測;ATP生物熒光增幅法;熒光標記

食品安全問(wèn)題的來(lái)源是多方面的，不僅包括原料質(zhì)量、加工技術(shù)、生產(chǎn)環(huán)境，更主要的是對其的保管與儲存[1]。對于部分特殊的食品，微生物污染是主要影響產(chǎn)品質(zhì)量的因素，而出現微生物污染的環(huán)節也是多樣性的，從原材料的產(chǎn)出到產(chǎn)品銷(xiāo)售，中間的任意環(huán)節都有可能出現微生物污染[2]。在食品被污染的前期，并不會(huì )在外觀(guān)上表現出明顯的變化，但食品本身很可能已經(jīng)變質(zhì)，如果不能及時(shí)檢出，在市面上被銷(xiāo)售，極有可能產(chǎn)生嚴重的食品安全問(wèn)題[3]。傳統的微生物檢測主要是對檢測物品進(jìn)行微生物培養，不僅對檢測操作的要求較高，檢測周期也相對較長(cháng)，這與現階段快節奏的生活方式并不契合，且其檢測結果也具有一定的失準性，效果并不理想[4]。ATP生物熒光增幅法作為近些年來(lái)逐漸被關(guān)注的微生物檢測方法，不但具有較高的檢測效率，同時(shí)操作更加便捷，在檢測領(lǐng)域得到了廣泛應用。

基于此，本文提出基于A(yíng)TP生物熒光增幅法的食品微生物污染檢測方法。使用ATP熒光對營(yíng)養物質(zhì)進(jìn)行標記，通過(guò)統計培養過(guò)后ATP熒光的增幅判斷食品中是否存在微生物污染，通過(guò)實(shí)驗驗證了該方法的有效性，以期為食品的微生物污染檢測提供有價(jià)值的參考。

1 食品微生物污染檢測

1.1 熒光染色標記

在傳統的食品微生物檢測中，主要是通過(guò)對樣本進(jìn)行細菌培養的方式判定其是否被污染，通過(guò)培養結果分析微生物存在的可能性，結果的可靠性相對較低[5]。本文將ATP生物熒光增幅法應用于微生物污染檢測中。

對營(yíng)養物質(zhì)進(jìn)行熒光標記，一般情況下，當食品中出現微生物污染時(shí)，隨著(zhù)微生物的衍生，其需要不斷吸取食品中的營(yíng)養物質(zhì)作為其生存的基礎，此時(shí)的食品可以理解為是微生物的營(yíng)養基，本文利用這一特點(diǎn)，在使用中加入包含熒光劑成分的高濃度營(yíng)養物質(zhì)。當食品中有微生物時(shí)，可以通過(guò)顯微觀(guān)察發(fā)現移動(dòng)的熒光，由于營(yíng)養液自身也是非靜態(tài)的，直接統計的結果存在一定偏差，利用動(dòng)態(tài)熒光的增加程度，可以實(shí)現對微生物數量的準確判斷。需要注意的是，在對營(yíng)養物質(zhì)進(jìn)行熒光染色時(shí)，要避免熒光在食品表面的印染，當其對食品本身產(chǎn)生染色作用時(shí)，會(huì )影響最終的統計結果，因此，本文選用ATP作為染色材料。

1.2 ATP熒光增幅分析

ATP生物熒光增幅檢測法本質(zhì)上是利用了微生物的生存需求和繁衍的基本原理，在完成對營(yíng)養物質(zhì)的標記后，在(37.5±0.5)℃的溫度環(huán)境中，培養2 h，再使用沖洗液對其表面進(jìn)行沖洗，此時(shí)需要注意沖洗的力度不應過(guò)大，否則會(huì )造成含有ATP熒光的微生物被全部沖走，無(wú)法進(jìn)行后續的檢測工作。沖洗完成的待檢食品需要在相對濕度為(60±5)%的環(huán)境中靜置10 min直至其表面處于干燥狀態(tài)。此時(shí)通過(guò)顯微鏡觀(guān)察食品表面是否存在A(yíng)TP熒光成分，如果不存在，則表明食品不存在微生物污染，如果存在，記錄觀(guān)察到的微生物數量。完成后再重新將其置于(37.5±0.5)℃的溫度環(huán)境培養2 h。完成后重復上面的操作，沖洗、晾干，再次在顯微環(huán)境下觀(guān)察ATP熒光的數量，統計其實(shí)際增量。如果ATP熒光的數量未出現變化，同樣表明檢測食品沒(méi)有出現微生物污染的情況，如果出現明顯的增幅，則表明存在微生物。結合其增幅與時(shí)間的關(guān)系，推斷微生物的總量。本文將ATP熒光增幅作為最終檢測結果的判定依據，避免了鹽、其他化學(xué)物質(zhì)和游離態(tài)在食品中的干擾，使檢測結果具有更高的準確性。

2 應用測試

對本文提出的微生物檢測方法進(jìn)行實(shí)際應用測試。并將文獻[2]和文獻[3]提出的檢測方法作為對照組，通過(guò)對比3種方法的檢測結果，分析本文方法的效果。

2.1 樣本設置

本文將復蘇的HFSCs細胞在DM EM/F12培養基中懸浮培養，共分為3組，另外取3個(gè)DM EM/F12培養基，進(jìn)行枯草芽孢桿菌的培養，白假絲酵母菌的培養，同樣將其置于分別接種到DM EM/F12培養基中，并將其置于溫度為(37.5±0.5)℃，相對濕度為(60±5)%的環(huán)境中，時(shí)間為2 h。最后取3個(gè)DM EM /F12培養基，直接置于溫度為(37.5±0.5)℃，相對濕度為(60±5)%的環(huán)境中培養2 h，將其作為陰性對照組。

2.2 實(shí)驗過(guò)程

選擇典型支原體污染試驗樣本作為陽(yáng)性對照。含

HFSCs玻片在不含抗生素的培養基中培養2 d后，吸取培養液，用PBS沖洗，用冷空氣干燥，用固定液固定5 min。將制備的ATP Hoechst3342工作染料添加到固定細胞中，并在室溫下染色30 min，染色的蓋玻片用PBS浸泡3次，每次3 min，用冷空氣干燥，含1%甘油的PBS覆蓋在細胞表面。密封處理后，干燥，觀(guān)察細胞核周?chē)欠癞a(chǎn)生ATP熒光。

2.3 檢測結果

在上述基礎上，對比3種方法對不同培養基的檢測結果，具體如表1所示。廖燮恒等[2]和白淼等[3]的方法均未實(shí)現對HFSCs的有效檢出，同時(shí)，廖燮恒等[2]方法對白假絲酵母菌的檢出不明顯，白淼等[3]的方法對枯草芽孢桿菌的檢出方法不明顯。相比之下，本文方法實(shí)現了對4組樣品的準確檢出，檢測結果更加可靠。

3 結論

隨著(zhù)食品加工行業(yè)的蓬勃發(fā)展，對食品質(zhì)量控制的重要性也越來(lái)越受到重視，其中微生物污染檢測作為一項難度較高，流程較為復雜的檢測環(huán)節，一直是產(chǎn)品質(zhì)量控制的重要方式。而微生物污染前期，食物外觀(guān)上的表現并不明顯，對其檢測也更加困難。本文提出的基于A(yíng)TP生物熒光增幅法的食品微生物污染檢測方法，并實(shí)現了對微生物的準確檢出。通過(guò)本文的研究，以期為食品安全檢測工作提供有價(jià)值的幫助。

參考文獻

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[2]廖燮恒,趙海鋒.微生物數碼顯微培養計數系統在固體粉末樣品檢測中的應用[J].現代食品科技,2021,37(5):279-286.

[3]白淼,張燦,張明露,等.動(dòng)態(tài)顯色法鱟試驗用于果汁細菌內毒素活性檢測及干擾分析[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報,2019,10(10):3192-3196.

[4]翟磊,葛媛媛,洪海軍,等.ATP生物熒光增幅法在微生物檢測中的可行性研究——應用于化妝品領(lǐng)域[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2020,46(21):201-206.

[5]李婷,沈穎,蔡俊松,等.ATP生物熒光增幅法在化妝品微生物檢測中的適用性研究[J].日用化學(xué)工業(yè),2021,51(6):513-521.