張超然1，王墨陽(yáng)2，林　林1

(1.哈爾濱美華生物技術(shù)股份有限公司，黑龍江哈爾濱 150010;

2.哈爾濱市疾病預防控制中心，黑龍江哈爾濱 150001)

摘　要：低聚木糖作為益生元，常應用于益生菌類(lèi)保健食品中。本文利用高效液相色譜-紫外檢測器，以鹽酸氨基葡萄糖作為內標物，進(jìn)行柱前衍生化后測定低聚木糖在益生菌保健食品中的含量。將樣品溶解后，經(jīng)硫酸水解，以苯基甲基吡唑啉酮()作為衍生化試劑，選擇流動(dòng)相為乙腈-0.05 mol/L的乙酸銨溶液，進(jìn)行梯度洗脫，水解前后的木糖含量差值，即為低聚木糖的含量。該測定方法在質(zhì)量濃度20～1 000 μg/mL的范圍內呈現良好的線(xiàn)性關(guān)系，其相關(guān)系數(2)為0.999 6，檢出限和定量限分別是1.9 mg/100 g和6.8 mg/100 g。加標回收率在88.7%～98.5%，相對標準偏差在1.1%～4.0%;在重復性試驗中，相對標準偏差為1.03%。結果表明該方法在測定益生菌類(lèi)保健食品中低聚木糖含量具有良好的準確性和靈敏度。

關(guān)鍵詞：低聚木糖;PMP柱前衍生;益生菌類(lèi)保健食品

低聚木糖來(lái)源廣泛，可從甘蔗渣、玉米棒、麥麩、稻殼和棉稈等植物中提取獲得[1]，含有2～10個(gè)木糖分子由β-1,4-糖苷鍵連接的低聚物[2]。低聚木糖具有多種生物活性，尤其是在益生菌保健食品中，作為益生元，為益生菌供能，具有促進(jìn)腸道益生菌的生長(cháng)的作用[3-4]，同時(shí)還可以加速脂肪代謝，改善鈣的吸收[5]，預防齲齒[6]，作為抗氧化劑[2]。因其具有較好的穩定性[1]，已被廣泛應用于食品、保健食品中。

現有的對低聚木糖測定的標準GB/T 35545—2017和QB/T 2984—2008，主要適用于以玉米芯為原料，經(jīng)酶解精制而成的低聚木糖，兩個(gè)標準為低聚木糖原料的測定標準，其檢測設備為高效液相色譜-示差檢測器，需要的標準品為木糖，木二糖至木六糖，葡萄糖及-阿拉伯糖。該方法作為食品中添加的低聚木糖的檢測手段，檢測成本高，同時(shí)益生菌類(lèi)保健食品中常含有大量的蛋白質(zhì)，大量蛋白質(zhì)在醇沉過(guò)程中包裹低聚木糖，使測量數據偏低，需要針對其測定方法進(jìn)行進(jìn)一步探究，可應用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器進(jìn)行食品中低聚木糖的測定[7-8]。有研究表明衍生化技術(shù)作為糖類(lèi)物質(zhì)分析的新技術(shù)，通過(guò)離子化效率，從而提高檢測的靈敏度。其中，以苯基甲基吡唑啉酮()為代表的,取代的吡唑啉酮類(lèi)衍生試劑和糖鏈還原性末端的反應在弱堿性介質(zhì)中進(jìn)行，具有條件溫和、衍生產(chǎn)物穩定無(wú)立體異構體紫外吸收強和適于多種類(lèi)型糖鏈分析等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應用于糖類(lèi)檢測[9]。林欽恒等[10]利用柱前衍生的方法測定了潤腸通便類(lèi)保健食品中低聚木糖的含量，錢(qián)韻旭等[11]對白花蛇舌草多糖成分分析中，利用柱前衍生-高效液相的方法確定其由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖組成。本文利用PMP柱前衍生-高效液相色譜法對于益生菌類(lèi)保健食品中低聚木糖含量的測定進(jìn)行系統地分析，并以鹽酸氨基葡萄糖作為內標物質(zhì)，對于本類(lèi)產(chǎn)品中低聚木糖的檢測具有重要的意義。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

益生菌類(lèi)保健食品產(chǎn)品，來(lái)自于哈爾濱美華生物技術(shù)股份有限公司。

木糖標準品(純度為99.5%)，中國藥品生物制品檢定所;D-氨基葡萄糖標準品(純度為99%)，中國藥品生物制品檢定所;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP，分析純)，天津市大茂化工有限公司;乙腈(色譜純)，美國FISHER公司;乙酸銨(優(yōu)級純)，福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司;甲醇(色譜純)，美國FISHER公司;試驗用水為去離子水;氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、三氯甲烷均為分析純，購自天津化學(xué)試劑公司。

1.2　儀器與設備

Ultimate 3000高效液相色譜儀(配有紫外檢測器)，賽默飛世爾科技;HH4恒溫水浴鍋，無(wú)錫沃信儀器制造有限公司;KQ-50B型超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司;FA2104電子分析天平(精度：0.000 1 g)，上海良平儀器儀表有限公司;VORTEX-KB3旋渦混合器，海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3　試驗方法

1.3.1　色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，美國FISHER公司;流動(dòng)相：乙腈-0.05 mol/L的乙酸銨溶液，梯度洗脫;柱溫：30 ℃;波長(cháng)：250 nm;流速：1.0 mL/min;進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2　標準溶液系列的配制

(1)內標溶液制備。配制適量10 mg/mL的D-鹽酸氨基葡萄糖溶液，作為內標溶液。

(2)標準溶液配制。準確稱(chēng)取適量木糖標準品于100 mL容量瓶中，用去離子水溶解配制成10 mg/mL的標準儲備溶液，再將儲備溶液稀釋成20.0 μg/mL、50.0 μg/mL、100.0 μg/mL、200.0 μg/mL、400.0 μg/mL和800.0 μg/mL的系列工作溶液，并分別按比例加入內標溶液。

1.3.3　樣品前處理

(1)樣品水解前溶液制備。準確稱(chēng)取樣品1.5 g(精確度為0.000 1 g)，用0.005 mol/L硫酸溶液溶解并超聲溶解，定容至10 mL，取0.5 mL樣品溶液，加入0.5 mL D-鹽酸氨基葡萄糖溶液，定容至50 mL。

(2)樣品水解后溶液制備。準確稱(chēng)取樣品1.5 g(精確度為0.000 1g)，用0.005 mol/L硫酸溶液溶解并超聲溶解，定容至10 mL，取0.5 mL樣品溶液，添加0.5 mL D-鹽酸氨基葡萄糖溶液，添加120 μL的4.0 mol/L硫酸溶液于沸水浴水解100 min，取出，冷卻，添加240 μL的4.0 mol/L NaOH溶液，用水定容至50 mL，備用。

1.3.4　衍生化反應

標準溶液與樣品水解前后溶液各吸取400 μL，加0.5 mol/L的PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)甲醇溶液與0.3 mol/L的氫氧化鈉溶液各400 μL，混勻，70 ℃水浴反應120 min。再加0.3 mol/L的鹽酸溶液調節至中性，混勻，冷卻后用三氯甲烷洗滌3次，棄去三氯甲烷液，水層過(guò)0.45 μm濾膜，待上機測定[10]。

1.4　低聚木糖的計算

計算水解前后木糖含量的差值即為低聚木糖(以木糖計)的含量。

2　結果與分析

2.1　流動(dòng)相的選擇

根據相關(guān)文獻，對常用于該試驗的流動(dòng)相進(jìn)行了總結，發(fā)現乙酸銨[2,8,11]和磷酸鈉[12]都可作為流動(dòng)相，不同的pH，對各糖類(lèi)物質(zhì)出峰時(shí)間及分離程度有影響，所以本試驗選取0.05 mol/L乙酸銨溶液，pH為5.0，7.0，8.0，分別用乙酸和三乙胺進(jìn)行pH調節;0.05 mol/L磷酸鈉，pH為8.0，用磷酸進(jìn)行調節，以上作為A相。B相為乙腈，進(jìn)行梯度洗脫。根據內標和外標物及產(chǎn)品的峰分離程度及出峰時(shí)間，選擇0.05 mol/L乙酸銨溶液(pH=5.0)-乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，分離效果最好。

2.2　內標物的選擇

由于前處理衍生化試驗中，需對溶液進(jìn)行pH調節，且前處理相對復雜，從而試驗操作誤差影響其溶液中木糖的含量，所以根據糖類(lèi)極性上的差異，選取鹽酸氨基葡萄糖作為內標物質(zhì)，對其測定值進(jìn)行校正。同時(shí)，鹽酸氨基葡萄糖在波長(cháng)250 nm下具有較大的吸收，且不會(huì )干擾產(chǎn)品中其他成分，所以鹽酸氨基葡萄糖對于該方法是比較好的內標物質(zhì)。

2.3　標準曲線(xiàn)、檢出限和定量限

本試驗配制的標準溶液濃度為20.0 μg/mL，50.0 μg/mL，100.0 μg/mL，200.0 μg/mL，400.0 μg/mL和800.0μg/mL，以木糖標準品的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標，衍生產(chǎn)物的響應值(Y)為縱坐標，低聚木糖質(zhì)量濃度在20~1 000 μg/mL的范圍內呈現良好的線(xiàn)性關(guān)系，得到的線(xiàn)性方程y=1.384 4x-1.098 6，相對系數(2)為0.999 6。按3倍信噪比計算檢出限為1.9 mg/100 g;以10倍信噪比計算定量限，定量限為6.8 mg/100 g。

2.4　準確度試驗

試驗選取了兩款低聚木糖含量不同的益生菌類(lèi)保健食品樣品，分別測出本底值，在根據不同樣品的低聚木糖含量，添加標準品(按樣品含量的80%、100%和120%)，每個(gè)水平制備5份樣品進(jìn)行測定。按照“1.2.4衍生化反應”試驗步驟進(jìn)行測定，計算回收率以及相對標準偏差(值)。結果表明，平均回收率為88.7%～98.5%，相對標準偏差為1.1%～4.0%。

2.5　重復性試驗

精密吸取樣品制備液10 μL，連續6次進(jìn)樣，測得的相對標準偏差為1.03%，證明該方法的精密度較高。

2.6　產(chǎn)品測定

選取本公司5款益生菌類(lèi)保健食品(n=3)進(jìn)行檢驗測定低聚木糖含量，檢測結果見(jiàn)表3，色譜圖見(jiàn)圖1和圖2。產(chǎn)品中含少量木糖成分，所以水解前測量值不為零，在計算時(shí)應減去。

3　結論

本文建立了測定益生菌類(lèi)保健食品中低聚木糖的測定方法，采用高效液相色譜-紫外檢測器并結合PMP柱前衍生化進(jìn)行測定。結果表明，由于樣品需經(jīng)過(guò)水解及柱前衍生化，前處理較為復雜，選擇以鹽酸氨基葡萄糖作為內標物質(zhì)，對實(shí)驗中產(chǎn)生的誤差進(jìn)行了校正，從而提高了檢測準確性。同時(shí)對方法的線(xiàn)性、靈敏度、回收率、重復性及實(shí)際產(chǎn)品測定等多個(gè)方面進(jìn)行了考察。結果表明，該方法具有較高的靈敏性及準確性，可應用于相關(guān)益生菌類(lèi)保健食品的低聚木糖含量的測定。

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作者簡(jiǎn)介：張超然(1989—)，女，遼寧黑山人，碩士，工程師。研究方向：食品質(zhì)量與安全。