彭 立

(宜春市糧油質(zhì)量監督檢驗站，江西宜春 336000)

摘 要：目的：選擇高效液相色譜法對糧油制品中黃曲霉毒素B1展開(kāi)快速測定。方法：提取、凈化并濃縮樣品中黃曲霉毒素B1后，確定流動(dòng)相為乙酸銨溶液(5 mmol/L)、乙腈-甲醇溶液(50︰50)，以梯度洗脫程序為依據，采取液相色譜法展開(kāi)測定，定量使用外標法。結果：在濃度范圍為0.2～20 ng/mL時(shí)，黃曲霉毒素B1線(xiàn)性回歸方程為=68 577.3-20 845，>0.998，線(xiàn)性關(guān)系良好;方法檢出限為0.07 μg/kg、定量限為0.2 μg/kg;加標回收率超過(guò)85.0%，不超過(guò)5.5%。結論：本實(shí)驗方法結果準確可靠、重復性好，可用于快速檢測糧油制品中黃曲霉毒素B1。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法;糧油食品;黃曲霉毒素;含量測定

Determination of Aflatoxin in Cereals, Oils and Foods by HPLC

PENG Li

(Yichun Grain and Oil Quality Supervision and Inspection Station, Yichun 336000)

Abstract: objective: to develop an HPLC method for the rapid determination of aflatoxin B1 in grain and oil products. Methods: after extraction, purification and concentration of aflatoxin B1 in the sample, the mobile phase was determined as ammonium acetate solution (5 mmol/L) and acetonitrile methanol solution (50:50). Based on the gradient elution procedure, the determination was carried out by liquid chromatography, and the external standard method was used quantitatively. Results: In the concentration range of 0.2～20 ng/mL, the linear regression equation of aflatoxin B1 was, and the linear relationship was good; The detection limit was 0.07 μg/kg,limit of quantitation 0.2 μg/kg;The recovery rate of standard addition is more than 85.0%,and the is not more than 5.5%.Conclusion: the results of this method are accurate, reliable and reproducible.It can be used for the rapid determination of aflatoxin B1 in grain and oil products.

Keywords: high performance liquid chromatography; grain, oil and food; aflatoxin; content determination

黃曲霉與寄生曲霉等菌株在特定溫濕度條件下會(huì )產(chǎn)生黃曲霉毒素，屬于一類(lèi)二級代謝產(chǎn)物，此類(lèi)毒素對人體有強烈致癌危害。黃曲霉毒素包含黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，其中毒性最強的為黃曲霉毒素B1。由于自然環(huán)境中存在的黃曲霉毒素相對較多，且對人類(lèi)的危害性極高，因此有必要做好相關(guān)的控制工作。目前，在檢測黃曲霉毒素時(shí)多選擇液相色譜法、金標試紙法、酶聯(lián)免疫法及液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等。其中，高效液相色譜法具備極高的靈敏度和可觀(guān)的準確性，能夠精確定量黃曲霉毒素，因此被廣泛應用于食品中黃曲霉毒素的檢測。本文選擇免疫親和柱凈化-高效液相色譜技術(shù)測定糧油食品中黃曲霉毒素B1。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈(色譜級);乙酸銨(分析純);0.22 μm

微孔有機濾膜;黃曲霉毒素免疫親和柱;黃曲霉毒素標準溶液(2 μg/mL)。實(shí)驗用糧油樣品獲取自近期本地市場(chǎng)抽樣。

1.2 儀器與設備

液相色譜儀(Agilent 1260);電子天平(梅特勒ME204E型);渦旋混合器(vortex genie2);臺式高速離心機(TG16)。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 配制標準儲備液

精準量取黃曲霉毒素標準溶液，加入適量甲醇稀釋為100 ng/mL濃度的標準儲備液。

1.3.2 配制標準工作液

分別量取0.20 μL、2.00 μL、5.00 μL、10.00 μL、20.00 μL標準儲備液置于樣品瓶?jì)?，加入初始比例流?dòng)相定容，完成濃度分別為0.20 ng/mL、2.00 ng/mL、5.00 ng/mL、10.00 ng/mL、20.00 ng/mL標準工作液的配制。

1.3.3 樣品提取

精準稱(chēng)取5.00 g糧油樣品置于離心管(50 mL)，加入甲醇-水溶液(70︰30)25.0 mL，渦旋混勻后轉移至超聲波儀內持續20 min提取后，再持續10 min離心(6 000 r/min)，收集上清液，待凈化。

1.3.4 樣品凈化

精準量取上清液5.0 mL，加入含1%吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液20 mL并混勻，待免疫親和柱原有液體恢復至室溫并流進(jìn)后，用注射器裝載上述樣液，控制下滴流速為1.0 mL/min，全部下滴后用水淋洗免疫親和柱(分2次，共計耗水20 mL)[1-2]。待滴完水后抽干免疫親和柱，用甲醇洗脫免疫親和柱(分2次，共計使用甲醇2 mL)，控制下滴流速為1.0 mL/min，用氮吹管裝載收集的洗脫液，50 ℃下氮氣吹干后，殘渣用初始比例流動(dòng)相(1 mL)溶解后，過(guò)0.22 μm微孔有機濾膜并轉移至進(jìn)樣小瓶?jì)?，待測。

1.3.5 色譜條件

選擇Shim-pack GIST C18色譜柱，100 mm×2.1 mm，2 μm;40 ℃柱溫，0.3 mL/min柱流量，10 μL進(jìn)樣體積[3]。流動(dòng)相A、B分別為乙酸銨溶液(5 mmol/L)、乙腈-甲醇溶液(50︰50).表1為梯度洗脫程序。

2 結果與分析

2.1 線(xiàn)性方程及相關(guān)性

根據1.3.1和1.3.2的步驟完成標準溶液的配制，檢測不同濃度的標準溶液，參照對應化合物濃度(X)和目標化合物響應峰面積(Y)獲取黃曲霉毒素B1線(xiàn)性回歸方程為Y=68 577.3X-20 845，線(xiàn)性范圍為0.2～20 ng/mL，R>0.998。

2.2 方法檢出限

精準量取適量的標準工作溶液，移至空白樣品溶液內，加入初始流動(dòng)相逐級稀釋?zhuān)詸z出限為信噪比S/N=3為根據，通過(guò)計算獲取0.07 μg/kg的黃曲霉毒素B1檢出限，以定量限為信噪比S/N=10為根據，通過(guò)計算獲取0.2 μg/kg的黃曲霉毒素B1定量限。

2.3 加標回收率及重現性

分別精準稱(chēng)取空白糧油樣品5.00 g，共計18份，圍繞1 ng/mL、4 ng/mL、15 ng/mL的水平對標準儲備分別進(jìn)行6次加標，通過(guò)處理檢測后得到黃曲霉毒素B1加標回收率及相對標準偏差。加標回收率超過(guò)85.0%，處于2.8%～5.5%，見(jiàn)表2。

2.4 實(shí)際樣品測定

為對該方法實(shí)用性與可靠性展開(kāi)驗證，參照上述實(shí)驗方法對2種能力驗證樣品及3種市場(chǎng)糧油制品進(jìn)行前處理后，獲取黃曲霉毒素B1含量測定結果，見(jiàn)表3。根據兩種能力驗證樣品中測定的黃曲霉毒素B1含量結果得知，比分數為-0.83，|Z|≤2，結果滿(mǎn)意，證實(shí)了該方法的準確性。以《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》(GB 2761—2017)中有關(guān)谷物及其制品、油脂及其制品中規定的黃曲霉毒素B1為5.0～20 μg/kg、10～20 μg/kg的安全限量為根據，市場(chǎng)糧油制品測定結果中的黃曲霉毒素B1含量與國家安全限量標準相符合。

2.5 實(shí)驗驗證

經(jīng)提取、凈化后的糧油制品，結合高效液相色譜法檢測黃曲霉毒素B1，獲取的結果與國家安全限量標準相符合，加標回收率超過(guò)85.0%，處于2.8%～5.5%。實(shí)際樣品檢測中，結果滿(mǎn)意，證實(shí)了方法準確性。本實(shí)驗方法結果準確可靠、重復性好，可用于快速檢測糧油制品中黃曲霉毒素B1。

3 討論與結論

3.1 檢測方法選擇

目前，可用于檢測黃曲霉毒素的方法有很多，如膠體金試紙條法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法、薄層色譜法及免疫親和柱-溴化熒光分光光度法等。其中，由于薄層色譜法會(huì )消耗大量溶劑，且重現性不太可觀(guān)，因此在檢測黃曲霉毒素中并不太適用[4]。膠體金試紙條法與酶聯(lián)免疫吸附法一般在快速篩查黃曲霉毒素中應用，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法能夠同時(shí)檢測多種真菌毒素，然而因本身需要使用過(guò)于昂貴的儀器，會(huì )產(chǎn)生較高的使用成本，故而也不太適用。免疫親和柱無(wú)需消耗太多有機溶劑，且特異性強、機制干擾少、靈敏度高，在多種復雜基質(zhì)樣品中適用，在精確定量及確認黃曲霉毒素中十分適用[5]。因此，本試驗在綜合對比多種方法的優(yōu)劣后，最終選擇了免疫親和柱凈化-高效液相色譜技術(shù)對糧油食品中的黃曲霉毒素B1展開(kāi)測定。

3.2 樣品前處理優(yōu)化

實(shí)驗室檢測樣品中黃曲霉毒素時(shí)，在樣品前處理方面多以手動(dòng)凈化的方式為主[6]。但是該凈化方式涉及了過(guò)于煩瑣的過(guò)程，且會(huì )消耗大量時(shí)間，每天能夠完成的樣本處理量較少，面對較大樣品量時(shí)會(huì )暴露出人為因素影響大、時(shí)效性低等不足。而通過(guò)免疫親和柱在線(xiàn)凈化高效液相色譜法的應用，能將上述不足有效彌補，大幅提升檢測時(shí)效性，且能為檢測結果提供準確性保障。

3.3 流動(dòng)相選擇

以標準GB 5009.22—2016中洗脫程序為根據，以甲醇-乙腈和水、乙腈-水、甲醇-乙腈和0.5 mmol/L乙酸銨溶液為對象，對比流動(dòng)相組合洗脫效果[7]。其中，甲醇-乙腈洗脫效率更顯著(zhù)，洗脫時(shí)間更短。通過(guò)乙酸銨溶液的添加，能獲取對稱(chēng)性良好的峰型，出峰時(shí)間更穩定，單個(gè)樣品測試時(shí)間更短。因此，在綜合對比多種流動(dòng)相的優(yōu)劣后，本實(shí)驗中確定流動(dòng)相為甲醇-乙腈(50︰50)溶液和乙酸銨溶液(0.5 mmol/L)。

3.4 提取劑選擇

本次實(shí)驗前對提取劑選擇甲醇-水溶液和乙腈-水溶液時(shí)的提取效果展開(kāi)對比分析，分析得到兩者之間不存在明顯差異，確定提取劑為成本相對更低的甲醇-水[8]。

參考文獻

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