秦俊蓮1,2，徐寧寧2

(1.廣東中測食品化妝品安全評價(jià)中心有限公司，廣東中山 528437;

2.廣東省科學(xué)院測試分析研究所(中國廣州分析測試中心)，廣東廣州 510070)

摘 要：隨著(zhù)我國經(jīng)濟發(fā)展和社會(huì )進(jìn)步，食品安全質(zhì)量已經(jīng)成為當今備受關(guān)注的社會(huì )問(wèn)題之一。食品微生物檢測是食品安全與質(zhì)量評價(jià)的重要技術(shù)手段之一，本文對食品微生物檢測的方法進(jìn)行了概述，包括傳統檢測方法、改進(jìn)后的培養檢測法、代謝技術(shù)法、生物傳感器法、免疫學(xué)技術(shù)法、分子生物學(xué)方法等，以期為食品微生物監測提供參考。

關(guān)鍵詞：食品安全;食品微生物;檢測技術(shù);方法

隨著(zhù)國際食品經(jīng)濟和貿易的發(fā)展，食品安全問(wèn)題受到社會(huì )的廣泛關(guān)注。食源性微生物引起的食品安全風(fēng)險已成為全球性問(wèn)題。國家食品安全調查數據顯示，2010年以來(lái)致病微生物導致的食物中毒事件數量一直多于化學(xué)性危害和有毒動(dòng)植物造成的危害。在病因明確的食源性疾病暴發(fā)事件中，由微生物因素引起的發(fā)病人數最多，占總數的43.88%。據中國疾病預防控制中心統計數據顯示，近十年，我國由食源性病原微生物引起的食品安全事故比例高達60%以上[1]。食源性疾病逐漸成為當今世界最突出的食品安全問(wèn)題，而微生物污染存在于食品的加工、生產(chǎn)和流通等各個(gè)環(huán)節。微生物檢測在食品安全評價(jià)及質(zhì)量監控方面發(fā)揮著(zhù)重要作用，限定食品中微生物存在量的閾值，建立完善的微生物檢測體系是保障食品安全的重要措施[2]。

食品微生物檢測主要包括菌落總數、大腸菌群和致病菌3個(gè)方面的檢測。檢測人員對食品進(jìn)行特殊處理，在特定環(huán)境下進(jìn)行培養，測定待測指標。除益生菌以外，一般而言，食品中菌落總數越多，表示該食品受微生物污染程度越嚴重，食品安全性越差。大腸菌群包含腸桿菌科的檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、埃希氏菌屬、克雷伯菌屬，屬于能產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌類(lèi)，這些細菌寄居于人或者溫血動(dòng)物腸道內，可隨大便排出寄主體外，食物受糞便污染的程度用大腸菌群系數表示。致病菌是指可導致人們產(chǎn)生疾病的細菌類(lèi)群，根據現行有效的食品安全國家標準，致病菌主要指腸道致病菌和致病性球菌，主要包括沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌等，食品安全標準要求食品中致病菌不得檢出。在實(shí)際檢測工作中，如大腸菌群檢測結果呈陽(yáng)性，則該食品受到致病菌污染可能性增加，可進(jìn)行致病菌指標檢測[3]，另外根據長(cháng)期檢測經(jīng)驗和特定產(chǎn)品類(lèi)型也可直接進(jìn)行某項致病菌檢測，如水產(chǎn)品的副溶血性弧菌。根據檢測需要，運用微生物學(xué)的理論與技術(shù)，檢測食品中可能存在的微生物的種類(lèi)、數量等，以判別食品是否符合國家食品安全質(zhì)量標準的過(guò)程為食品微生物檢測，其主要方法如下。

1 傳統檢測方法

傳統檢測方法是基于微生物形態(tài)學(xué)和培養特性為評價(jià)標準的方法。長(cháng)期以來(lái)，傳統食品微生物檢測一直遵循增菌培養、分離純化、形態(tài)學(xué)和生化、血清學(xué)鑒定的傳統方法。傳統檢測方法準確性和靈敏度較高，但檢測流程繁雜、檢測時(shí)間長(cháng)、準備和收尾工作繁重、效率不高等問(wèn)題突出[2]，尤其是部分類(lèi)別的食品保質(zhì)期短，采用傳統檢測方法，嚴重影響和制約了食品在市場(chǎng)上的銷(xiāo)售及流通。此外，傳統檢測方法無(wú)法對難培養或不可培養的微生物進(jìn)行檢測。隨著(zhù)儀器自動(dòng)化、分子生物學(xué)等分析技術(shù)的發(fā)展，開(kāi)發(fā)、應用并推廣準確高效的食品微生物檢測方法是食品安全檢測的重要目標之一。

2 改進(jìn)后的培養檢測法

基于傳統檢測方法，對培養基成分進(jìn)行改良，在培養過(guò)程中加入指示劑、顯色劑、抑菌劑、熒光物質(zhì)等來(lái)完善培養，可提高培養基的特異性增菌或分離效果。對培養基的使用便利性進(jìn)行升級改進(jìn)，如快速檢測紙片、集成化生化鑒定試劑條及儀器自動(dòng)化技術(shù)在食品微生物檢測方面具有顯著(zhù)優(yōu)點(diǎn)。

3 代謝技術(shù)法

在微生物生長(cháng)過(guò)程中，可根據代謝產(chǎn)物變化、生物電阻抗等特征開(kāi)展微生物檢測工作，達到食品微生物安全檢測目的。利用定量細菌生長(cháng)過(guò)程中釋放的熱量變化，以對微生物定量和定性的技術(shù)稱(chēng)為微熱量技術(shù)。此外，隨著(zhù)代謝組學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展和微生物揮發(fā)性代謝產(chǎn)物數據庫的建立，食源性致病菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物分析已被建議作為臨床和食品中致病菌鑒別的替代方法[4]。

4 生物傳感器法

生物傳感是指對生物活性物的理化性質(zhì)變化產(chǎn)生感應，它通過(guò)物理、化學(xué)換能器捕捉目標物與敏感元件之間的反應，然后將反應的程度用不連續或連續的數字電信號呈現出來(lái)，從而得出目標物質(zhì)的濃度。生物傳感器法主要有光學(xué)傳感器、生物發(fā)光傳感器和壓電免疫傳感器三種。光學(xué)傳感器適用于檢測能產(chǎn)生熒光素的細菌，但靈敏度不高。生物發(fā)光傳感法特異性好，可區分活菌體和死菌體，但檢測耗時(shí)較長(cháng)。壓電免疫傳感器有利于進(jìn)行生命體活動(dòng)的研究，因此成為生物傳感器的研究熱點(diǎn)之一。

5 免疫學(xué)技術(shù)法

利用抗原與抗體間的特異性結合反應，通過(guò)病原體的催化作用形成免疫球蛋白，可實(shí)現對食品微生物的免疫學(xué)檢測。目前，免疫學(xué)技術(shù)廣泛應用于檢測沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌和彎曲桿菌等病原菌。免疫技術(shù)主要包括免疫層析技術(shù)、酶聯(lián)免疫法和免疫磁珠。免疫層析是根據免疫抗體-抗原的相互吸附原理設計出的一種制備收集或檢測分析技術(shù)。酶聯(lián)免疫法是一種固相免疫測定技術(shù)，依據抗原抗體的特異性，并結合酶的作用，明確微生物的數量，具有靈敏度高、特異性強、方便快捷等特點(diǎn)，廣泛應用于多細菌檢測。免疫磁珠捕獲法是通過(guò)免疫磁珠對目標微生物進(jìn)行針對性的富集，提高傳統方法的敏感性?！妒称钒踩珖覙藴?食品微生物學(xué)檢驗 總則》(GB 4789.1—2016)已將免疫磁珠捕獲法作為檢驗大腸桿菌O157:H7的推薦方法。

6 分子生物學(xué)方法

隨著(zhù)分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和廣泛應用，聚合酶鏈式反應(PCR)成為食品微生物檢測常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一。在食品微生物檢測技術(shù)中，以具有高度保守的核酸序列為對象設計特異引物進(jìn)行擴增，通常為16S rRNA基因的高變異片段，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量或者凝膠電泳聯(lián)合紫外核酸檢測儀觀(guān)察擴增結果，已到達最終檢測食品中是否有某種致病菌的存在。在多種分子生物學(xué)手段中，依賴(lài)PCR的DNA指紋圖譜技術(shù)、定量PCR技術(shù)、基因探針技術(shù)、多重PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)等均得以廣泛應用。此外，還有基于等溫擴增技術(shù)的環(huán)介導恒溫擴增(LAMP)法、NASBA法等也被應用到食品微生物檢測技術(shù)中。

6.1 DNA指紋圖譜技術(shù)

DNA指紋圖譜技術(shù)是基于改進(jìn)的PCR技術(shù)，將目標微生物的核酸進(jìn)行擴增，產(chǎn)生多條特異性與非特異性的DNA擴增片段，而后通過(guò)微生物的特有條帶進(jìn)行區別鑒定。DNA指紋圖譜技術(shù)主要包括隨機引物擴增DNA多態(tài)性(RAPD)技術(shù)和基因內重復性一致序列(ERIC)擴增技術(shù)。

6.2 多重PCR技術(shù)

多重PCR技術(shù)是在同一個(gè)反應體系中同時(shí)加入多對特異性引物，如樣品中存在與各引物特異性互補的片段，即可同時(shí)擴增，實(shí)現一次擴增檢測多種致病菌的目的。該方法適用于同時(shí)需要檢測多個(gè)目標菌的樣品，可大大提高檢測效率。

6.3 定量PCR檢測技術(shù)

定量PCR檢測技術(shù)是在PCR反應體系中加入標記物，通過(guò)標記物的量變化或熒光強度變化，同時(shí)實(shí)現定性定量。應用較廣泛的技術(shù)包括內標定量PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR。在PCR反應管中加入內標物，可消除PCR擴增過(guò)程中不同反應體系間以及標本間存在的差異與干擾，因此，選擇合適的標記物是內標定量PCR方法的關(guān)鍵點(diǎn)之一。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累變化實(shí)時(shí)監測整個(gè)PCR進(jìn)程的手段，最后通過(guò)標準曲線(xiàn)對未知模板進(jìn)行定量分析。RUDI等[5]采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，快速檢測出了食品樣品中的單核增生李斯特氏菌。此外，其他研究者還利用PCR技術(shù)與免疫磁珠技術(shù)、酶聯(lián)免疫法相結合，快速測定了食品中的大腸桿菌和沙門(mén)氏菌。

6.4 基因探針檢測方法

每一種生物都有獨特的核酸片段，病原微生物也有其特定DNA片段，通過(guò)分離和標記這些片段可制備出探針?；蛱结樇夹g(shù)已被廣泛應用于食品安全微生物檢測中，可靈敏、快速、直接的檢測出樣品中的特定目標微生物，而不受其他微生物類(lèi)群存在的干擾。目前，市面上已有多種商品化的基因探針試劑盒出品，如美國Gene-Trak公司開(kāi)發(fā)的利用特異的基因探針對單增李斯特氏菌、沙門(mén)氏菌、和大腸桿菌的16S rRNA進(jìn)行檢測的脫氧核糖核酸雜交篩選比色法試劑盒。

6.5 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是將大量已按檢測要求制作好的探針固化，通過(guò)一次雜交同時(shí)檢測多種靶基因的技術(shù)，是目前檢測食品中有害微生物最有效最高效的手段之一。通過(guò)設計通用引物擴增細菌16S rRNA，然后將擴增產(chǎn)物與含有探針的芯片進(jìn)行雜交，在短時(shí)間內即可鑒定出大腸桿菌(3～4 h)、沙門(mén)氏菌和葡萄球菌等致病性微生物。KIM等[6]采用比較基因組學(xué)技術(shù)，針對11種常見(jiàn)的食物源性致病微生物設計出了新型探針芯片，與全基因組芯片相比，可更加快速準確地檢測出食品中的致病性微生物。

7 展望

隨著(zhù)微生物檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，檢測方法也越來(lái)越多樣化。食品微生物檢測技術(shù)將會(huì )向自動(dòng)化、快速化、靈敏度高、特異性強、重復性好以及簡(jiǎn)易、經(jīng)濟的方向不斷發(fā)展。每一種檢測方法都有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，為提高準確性，在食品檢測時(shí)可根據實(shí)際情況選擇合適的方法，也可以選擇幾種方法結合使用，不斷提高檢測的準確度，確保食品在制作、生產(chǎn)、包裝和運輸等每個(gè)環(huán)節中的質(zhì)量安全。此外，檢驗人員在食品微生物檢測中發(fā)揮著(zhù)主導作用，要加強其對檢測技術(shù)、流程和標準的掌握程度，將理論和實(shí)踐緊密結合，從而獲得精準的檢測結果。

微生物污染存在于食品工業(yè)生產(chǎn)銷(xiāo)售的整個(gè)過(guò)程，微生物種類(lèi)繁多且容易變異，污染情況和分布規律復雜，檢測技術(shù)相對落后和控制機理研究缺乏等諸多原因為食品微生物檢測造成諸多困境。因此，不斷加強我國食品微生物風(fēng)險分析能力和微生物定量風(fēng)險評估，以減少與發(fā)達國家的差距，切實(shí)保障糧食的質(zhì)量安全，維護人們的根本利益，勢在必行。建立食品微生物安全風(fēng)險數據庫是保障食品安全的基礎手段之一，此數據庫包括數據中心與資源共享平臺、綜合評價(jià)指標體系、綜合評價(jià)指數模型和風(fēng)險預警模型四大關(guān)鍵平臺，其中綜合評價(jià)指標體系由微生物菌種資源庫、微生物檢測項目庫、微生物檢測方法庫、危害物質(zhì)信息庫、微生物安全國際標準指標庫構成。通過(guò)數據庫掌握了7大類(lèi)食品的致病微生物污染率及污染水平，為微生物安全研究提供了基礎數據和菌種資源，對我國建設高水平、高質(zhì)量的食品安全保障體系具有重要意義。綜上所述，食品安全關(guān)系國計民生，隨著(zhù)科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，食品微生物檢測方法和體系將不斷完善，廣大科研工作者需要共同努力，不斷改進(jìn)和豐富現有的檢測技術(shù)，研發(fā)開(kāi)創(chuàng )新的檢測方法，為食品安全保駕護航。

參考文獻

[1]吳清平,李玉冬,張菊梅.常見(jiàn)食源性致病菌代謝組學(xué)研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報,2016,43(3):609-618.

[2]李娜,王一村,高靜靜,等.快速檢測技術(shù)在食品微生物檢測中的應用研究[J].現代食品,2021,9(46):162-164.

[3]趙程.食品微生物檢驗和檢測技術(shù)[J].現代食品,2020,15(35):120-122.

[4]吳清平.食品微生物安全風(fēng)險數據庫在包裝飲用水行業(yè)的應用[J].飲料工業(yè),2015,18(2):74-77.

[5]RUDI K,NATERSTAD K,DROMTORP S,et al.Detection of viable and dead on gouda-like cheeses by real-time PCR[J].Lett Appl Microbiol,2005,40(4):301-306.

[6]KIM H J,PARK S H,LEE T H,et al.Microarray detection of foodborne pathogens using specific probes prepared by comparative genomics[J].Biosens Bioelectron,2008,24(2):238-246.