□ 何瑛 林木娣 賴(lài)書(shū)瑩 劉傳栩 梁俊健 廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司檢測中心

　　摘 要：本文建立了使用紫外分光光度計測定原料乳及乳制品中硫氰酸鈉含量的方法，方法利用硫氰酸鈉與硝酸鐵反應產(chǎn)物硫氰酸鐵的光度值間接測定硫氰酸鈉的含量。結果顯示，吸光度與硫氰酸鈉質(zhì)量濃度線(xiàn)性關(guān)系、檢出限實(shí)驗、重復性實(shí)驗、回收率實(shí)驗等方法學(xué)實(shí)驗均效果良好，測得結果與離子色譜法結果沒(méi)有顯著(zhù)性差異，提示方法可行，適于乳品企業(yè)對硫氰酸鈉的快速檢測。

　　關(guān)鍵詞：硫氰酸鈉 紫外分光光度法 硝酸鐵 乳及乳制品硫氰酸鈉(NaSCN)是生乳中天然存在的一種活性抗菌體系，其乳過(guò)氧化物酶體系(LPS)可以抑菌保鮮。1991年，WHO和FAO的食品法典委員會(huì )公布的CAC/GL 13-1991《乳過(guò)氧化物酶體系用于原料乳的保鮮指南》中，硫氰酸鈉作為L(cháng)PS的活化劑[1]被允許添加到牛奶中;我國也于隨后頒布標準，允許將其添加到無(wú)冷鏈運輸體系中用于原料乳保鮮，添加量為15mg/L[2～3]。

　　但硫氰酸鈉屬有毒有害物質(zhì)，其主要毒性作用為以抑制細胞色素氧化酶活性為主的急性毒性與以抑制碘轉運及甲狀腺素合成的慢性毒性，尤其對胎兒和嬰兒的腦部與神經(jīng)系統發(fā)育存在較大的危害[4]。隨著(zhù)社會(huì )對食品安全重視度提高及原奶冷鏈運輸的完善，國家廢除了之前的標準并于2008年12月公布《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單(第一批)》，規定乳及乳制品中硫氰酸鈉屬違法添加物質(zhì)。

　　目前，我國尚未制定檢測牛奶中硫氰酸鈉的標準及限值。本文采用紫外分光光度法測定牛奶中硫氰酸鈉含量，與離子色譜法相比，其操作簡(jiǎn)捷且結果準確，儀器易普及，適合在各乳品企業(yè)推廣使用。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料與試劑

　　1.1.1 材料

　　生乳采自廣東、福建、廣西、天津等地的奶牛場(chǎng);原料乳粉為新西蘭進(jìn)口奶粉;乳制品包括市售巴氏殺菌乳、UHT滅菌乳、調制乳等。

　　1.1.2 試劑

　　1.1.2.1 三氯乙酸溶液(200g/L)：稱(chēng)取三氯乙酸200.0g，用純水溶解并稀釋至1000mL;

　　1.1.2.2 硝酸鐵溶液(16g/L)：稱(chēng)取硝酸鐵(Fe(NO3)3•9H2O)2.674g，用純水溶解并稀釋至100mL，加入2mL濃硝酸，避光保存;

　　1.1.2.3 硫氰酸鈉標準儲備液(1000mg/L)：將硫氰酸鈉標準品(光譜純，GR)置于80℃烘箱內干燥2h，準確稱(chēng)取干燥后的硫氰酸鈉0.1000g于100mL容量瓶中，用純水定容至刻度，混勻后置于4℃避光保存;

　　1.1.2.4 硫氰酸鈉標準工作液(100mg/L)：準確吸取1.00mL硫氰酸鈉標準儲備液到10mL容量瓶中，用純水定容至刻度，混勻后備用，該試劑應現配現用。除非另有說(shuō)明，本實(shí)驗中使用的均為分析純試劑和GB/T 6682-2008中規定的一級水。

　　1.1.3 儀器設備

　　UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計，電子分析天平，離心機，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，渦旋振蕩器，移液槍。

　　1.2 方法建立

　　1.2.1 實(shí)驗原理

　　牛奶中加入三氯乙酸(TCA)除去蛋白質(zhì)和脂肪，過(guò)濾后取上清液加入高鐵化合物，利用硫氰酸根與三價(jià)鐵離子在pH值為1.0～1.5的條件下反應生成血紅色的硫氰酸鐵絡(luò )合物[5]，在最大吸收波長(cháng)處測定吸光度值，根據吸光度標準曲線(xiàn)確定其中硫氰酸鈉的含量。

　　1.2.2 樣品處理

　　(1)生乳或液態(tài)乳制品：吸取15mL樣品于50mL的離心管中，邊振搖邊加入三氯乙酸溶液(1.1.2.1)10mL，充分混勻后靜置15～30min，然后將樣品離心(9000rad/min，3min)分離，上清液經(jīng)定性濾紙雙層過(guò)濾、棄去初濾液后待測。(2)乳粉：稱(chēng)取10.0g奶粉于200mL燒杯中，用65～80℃溫水1︰10進(jìn)行溶解，冷卻后吸取該溶液15mL于50mL離心管，同1.2.2.1處理。

　　1.2.3 樣品測定

　　分別吸取4mL待測液于10mL比色管中，加入2mL硝酸鐵溶液(1.1.2.2)，混勻，反應10min后在450nm波長(cháng)處測定吸光度值，以三氯乙酸溶液加顯色劑作為試劑空白調零。測得的反應液吸光值應減去樣品濾液的本底吸光值，得到凈吸光值,將凈吸光值代入標準曲線(xiàn)計算出樣品中硫氰酸鈉的含量。

　　1.2.4 標準曲線(xiàn)的繪制

　　取10mL比色管7支，選擇反應液凈吸光度值與試劑空白最接近的樣品濾液作底液，分別吸取0、20、40、80、160、320、640μL硫氰酸鈉標準工作液(1.1.2.4)，用底液定容至4mL，配制成濃度為0、0.5、1、2、4、8、16mg/L的硫氰酸鈉基質(zhì)加標溶液，然后加入2mL硝酸鐵溶液混勻后靜置10min顯色，以試劑空白調零，在450nm波長(cháng)處測定吸光度值，將測得的吸光值減去底液吸光值后得到的凈吸光值對硫氰酸鈉質(zhì)量濃度作圖。

　　1.2.5 計算

　　樣品中硫氰酸鈉的含量按以下公式進(jìn)行計算：

　　其中：C為樣品中硫氰酸鈉的含量，mg/L;C0為由標準曲線(xiàn)得出的待測濾液中硫氰酸鈉的含量，mg/L;V1為取樣量，mL;V2為樣品最終體積，mL;f為稀釋倍數，液態(tài)樣品f=1，固態(tài)樣品f=10。

　　2 分析與討論

　　2.1 沉淀劑的加入量

　　實(shí)驗分別加入不同量的三氯乙酸溶液對樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行沉淀、離心(9000rad/min，3min)和過(guò)濾，然后將濾液靜置一段時(shí)間觀(guān)察沉淀效果，結果見(jiàn)表1，最終選擇樣品與沉淀劑的比例為30︰20進(jìn)行前處理。

　　2.2 檢測波長(cháng)的確定

　　取16mg/L的硫氰酸鈉基質(zhì)加標溶液，顯色后在400～700nm可見(jiàn)光區進(jìn)行光譜掃描(見(jiàn)圖1)，在此區域內溶液于波長(cháng)450nm處有1個(gè)最大吸收峰，此時(shí)樣品的吸光度值最大，響應最靈敏，且該波長(cháng)前后吸收曲線(xiàn)斜率較小，故選擇450nm作為檢測波長(cháng)。

　　2.3 顯色劑及反應時(shí)間的確定

　　硫氰酸鈉能與Fe3+反應生成硫氰酸鐵紅色絡(luò )合物。實(shí)驗初期考慮使用FeCl3溶液作為顯色劑，但其顯色不穩定且本底顏色較深，影響結果的準確測定;而Fe(NO3)3溶液中加入少量的濃硝酸后可抑制Fe3+的水解，本底顏色淺，可作為顯色劑使用，實(shí)驗發(fā)現其用量對顯色效果有明顯影響。

　　由圖2可以看出，取4mL 20mg/L硫氰酸鈉基質(zhì)加標溶液進(jìn)行顯色反應，反應液吸光值隨Fe(NO3)3加入量的增大而增大，當加入量為2mL時(shí)，曲線(xiàn)斜率較大，之后趨于平緩。實(shí)驗選定濾液與顯色劑的用量為4︰2并進(jìn)行顯色穩定性實(shí)驗，結果如表2所示。

　　由表2可得，隨著(zhù)反應時(shí)間的推移，至反應后1h內，不同濃度的硫氰酸鈉基質(zhì)加標溶液吸光值(OD值)變化不大，根據實(shí)際操作情況，本實(shí)驗選定顯色反應時(shí)間為10min。

　　2.4 標準曲線(xiàn)底液的選擇

　　實(shí)驗發(fā)現牛奶底液成分對測定結果的影響較大，分別用純水、三氯乙酸溶液、空白奶樣(反應液凈吸光度值與試劑空白最接近的樣品，經(jīng)離子色譜法測定未檢出NaSCN)濾液作為底液配制標準曲線(xiàn)，測得的硫氰酸鈉加標回收率如表3所示，最終選擇空白奶樣濾液作為本底構建標準曲線(xiàn)。

　　3 結果與驗證

　　3.1 標準曲線(xiàn)的建立

　　按1.2.4的步驟進(jìn)行實(shí)驗，以硫氰酸鈉基質(zhì)加標溶液的濃度為橫坐標，對應的凈吸光度值為縱坐標，建立標準曲線(xiàn)如圖3所示，得到回歸方程y=0.021x+0.021，相關(guān)系數R2=0.9997?？梢?jiàn)，硫氰酸鈉濃度為0～16mg/L范圍內，其質(zhì)量濃度與吸光度線(xiàn)性關(guān)系良好。

　　3.2 檢出限與回收率實(shí)驗

　　按上述方法進(jìn)行20次空白溶液測量，得到標準偏差S=0.0005，分別以3倍、10倍標準偏差除以工作曲線(xiàn)斜率計得方法最低檢出限為0.07mg/L，最低定量限為0.25mg/L。

　　為驗證曲線(xiàn)可靠性，任意選取一種奶樣進(jìn)行加標回收實(shí)驗。分別吸取硫氰酸鈉標準儲備液0.015、0.03、0.06、0.18、0.30、1.20mL，加入液體奶樣至60mL，充分混勻后吸取15mL按上述方法進(jìn)行實(shí)驗，每個(gè)標樣平行測定3次，取平均值計算回收率，結果見(jiàn)表4。實(shí)驗測得回收率在95.24%～101.19%之間，準確度較高。

　　3.3 重現性實(shí)驗

　　任意選取生乳、原料乳粉、純牛奶和調制乳樣品各一個(gè)，按上述方法進(jìn)行處理，平行測定6次，實(shí)驗結果見(jiàn)表5。由表5可見(jiàn)，重復實(shí)驗結果相對標準偏差在1.16%～2.38%之間，本方法對原料乳及乳制品中硫氰酸鈉含量的測定重現性良好。

　　3.4 與離子色譜法的比較

　　取各類(lèi)牛奶樣品6個(gè)，分別用離子色譜法和紫外分光光度法測定硫氰酸鈉含量，檢測結果如表6所示。對兩組數據作t檢驗，t=0.361

　　4 總結

　　實(shí)驗測得各大牧場(chǎng)生乳樣品中硫氰酸鈉的含量在0.25～5mg/L之間，檢出率較高但含量較低，可排除人為添加的可能，系屬于奶牛防御體系天然存在的硫氰酸鹽。本法具有操作簡(jiǎn)捷、成本低、靈敏度較高、重現性好、回收率高的特點(diǎn)，與離子色譜法測得結果之間無(wú)顯著(zhù)性差異，適用于生鮮乳、原料乳粉及加工后的乳制品中硫氰酸鈉的快速測定。

　　參考文獻

　　[1] 李瀅倩.離子色譜和高效液相色譜測定牛乳中硫氰酸鹽含量的研究[D].吉林：吉林大學(xué)，2010：2-3.

　　[2] 中華人民共和國國家技術(shù)監督局. GB/T 15550-1995活化乳中乳過(guò)氧化物酶體系保存生鮮牛乳實(shí)施規范[S]. 北京：中國標準出版社，1995.

　　[3] 中華人民共和國衛生部. GB 2760-1996食品添加劑使用衛生標準[S]. 北京：中國標準出版社，1996.

　　[4] 蔭碩焱，賀巍巍，趙凱等. 乳品中硫氰酸鹽的食品安全對策[J].衛生研究，2013，42(3)：529-631.

　　[5] 王丹慧，張鳳梅，李梅等. 鐵鹽法定量檢測原料乳中硫氰酸鹽[J]. 食品科學(xué)，2010，31(18)：298-300.