空氣、食品接觸面微生物檢驗方法、檢驗標準

　　1、 目的：

　　檢測生產(chǎn)車(chē)間空氣、操作人員手部、與食品有直接接觸面的機械設備的微生物指標，生產(chǎn)區域環(huán)境當中病原微生物的監控，達到規定標準，以控制食品成品的質(zhì)量。

　　2、 參照標準：

　　中華人民共和國國家標準《一次性使用衛生用品衛生標準》GB15979-1995、《HACCP原理與實(shí)施》、中華人民共和國國家標準《公共場(chǎng)所空氣微生物檢驗方法細菌總數測定》GB/T 18204.1-2000、中華人民共和國進(jìn)出口商品檢驗行業(yè)標準SN 0169-92/SN 0172-92/ SN 0170-92、 出入境檢驗檢疫局二000四年《出入食品微生物檢驗培訓教材》中《出入食品生產(chǎn)廠(chǎng)衛生細菌檢驗方法》、日本東京冷凍食品檢驗方法。

　　3、 采樣與檢測方法：

　　3.1空氣的采樣與測試方法

　　3.1.1樣品采集：

　　(1)取樣頻率：

　　a)車(chē)間轉換不同衛生要求的產(chǎn)品時(shí)，在加工前進(jìn)行采樣，以便了解車(chē)間衛生清掃消毒情況。

　　b)全廠(chǎng)統一放長(cháng)假后，車(chē)間生產(chǎn)前，進(jìn)行采樣。

　　c)產(chǎn)品檢驗結果超內控標準時(shí)，應及時(shí)對車(chē)間進(jìn)行采樣，如有檢驗不合格點(diǎn)，整改后再進(jìn)行采樣檢驗。

　　d)實(shí)驗性新產(chǎn)品，按客戶(hù)規定頻率采樣檢驗。

　　e)正常生產(chǎn)狀態(tài)的采樣，每周一次。

　　(2)采樣方法

　　在動(dòng)態(tài)下進(jìn)行，室內面積不超過(guò)30 m2，在對角線(xiàn)上設里、中、外三點(diǎn)，里、外點(diǎn)位置距墻1 m;室內面積超過(guò)30 m2，設東、西、南、北、中五點(diǎn)，周?chē)?點(diǎn)距墻1 m。采樣時(shí)，將含平板計數瓊脂培養基的平板(直徑9 cm)置采樣點(diǎn)(約桌面高度)，并避開(kāi)空調、門(mén)窗等空氣流通處，打開(kāi)平皿蓋，使平板在空氣中暴露5 min。采樣后必須盡快對樣品進(jìn)行相應指標的檢測，送檢時(shí)間不得超過(guò)6h，若樣品保存于0～4℃條件時(shí)，送檢時(shí)間不得超過(guò)24h。

　　3.1.2菌落培養：

　　(1)在采樣前將準備好的平板計數瓊脂培養基平板置37℃±1℃培養24 h，取出檢查有無(wú)污染，將污染培養基剔除。

　　(2)將已采集樣品的培養基在6 h內送實(shí)驗室，細菌總數于37℃±1℃培養48h觀(guān)察結果，計數平板上細菌菌落數。

　　(3)菌落計算：

　　a)記錄平均菌落數，用“個(gè)/皿”來(lái)報告結果。用肉眼直接計數，標記或在菌落計數器上點(diǎn)計，然后用5～10倍放大鏡檢查，不可遺漏。

　　b)若培養皿上有2個(gè)或2個(gè)以上的菌落重疊，可分辨時(shí)仍以2個(gè)或2個(gè)以上菌落計數。

　　3.2工作臺(機械器具)表面與工人手表面采樣與測試方法：

　　3.2.1樣品采集：

　　(1)取樣頻率：

　　a)車(chē)間轉換不同衛生要求的產(chǎn)品時(shí)，在加工前進(jìn)行擦拭檢驗，以便了解車(chē)間衛生清掃消毒情況。

　　b)全廠(chǎng)統一放長(cháng)假后，車(chē)間生產(chǎn)前，進(jìn)行全面擦拭檢驗。

　　c)產(chǎn)品檢驗結果超內控標準時(shí)，應及時(shí)對車(chē)間可疑處進(jìn)行擦拭，如有檢驗不合格點(diǎn)，整改后再進(jìn)行擦拭檢驗。

　　d)實(shí)驗新產(chǎn)品，按客戶(hù)規定擦拭頻率擦拭檢驗。

　　e)對工作表面消毒產(chǎn)生懷疑時(shí)，進(jìn)行擦拭檢驗。

　　f)正常生產(chǎn)狀態(tài)的擦拭，每周一次。

　　(2) 采樣方法：

　　a)工作臺(機械器具)：用浸有滅菌生理鹽水的棉簽在被檢物體表面(取與食品直接接觸或有一定影響的表面)取25cm2的面積，在其內涂抹10次，然后剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內送檢。

　　b)工人手：被檢人五指并攏，用浸濕生理鹽水的棉簽在右手指曲面，從指尖到指端來(lái)回涂擦10次，然后剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內送檢。

　　(3)采樣注意事項：

　　擦拭時(shí)棉簽要隨時(shí)轉動(dòng)，保證擦拭的準確性。對每個(gè)擦拭點(diǎn)應詳細記錄所在分場(chǎng)的具體位置、擦拭時(shí)間及所擦拭環(huán)節的消毒時(shí)間

　　3.2.2細菌·大腸菌群的檢測培養:

　　樣液稀釋?zhuān)簩⒎庞忻薨舻脑嚬艹浞终駬u。此液為1：10稀釋液。如污染嚴重，可十倍遞增稀釋?zhuān)?ml 1：10樣液加9ml無(wú)菌生理鹽水中，混勻，此液為1：100稀釋液。

　　3.2.2.1細菌總數：

　　(1)以無(wú)菌操作，選擇1～2個(gè)稀釋度各取1ml樣液分別注入到無(wú)菌平皿內，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿(平行樣)，將已融化冷至45℃左右的平板計數瓊脂培養基傾入平皿，每皿約15ml，充分混合。

　　(2)待瓊脂凝固后，將平皿翻轉，置36℃±1℃培養48 h后計數。

　　(3)結果報告：報告每25cm2食品接觸面中或每只手的菌落數

　　3.2.2.2大腸菌群：

　　(1)平板法:

　　a)以無(wú)菌操作，選擇1～2個(gè)稀釋度各取1ml樣液分別注入到無(wú)菌平皿內，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿(平行樣)，將已融化冷至45℃左右的去氧膽酸鹽瓊脂培養基傾入平皿，每皿約15ml，充分混合。待瓊脂凝固后,再覆蓋一層培養基，約3-5 ml。

　　b)待瓊脂凝固后，將平皿翻轉，置36℃±1℃培養24h后計數。

　　c)結果計算： 以平板上出現紫紅色菌落的個(gè)數乘以稀釋倍數得出。

　　d)結果報告：報告每25cm2食品接觸面中或每只手的菌落數

　　(2)試管法:

　　a)以無(wú)菌操作，選擇3個(gè)稀釋度各取1ml樣液分別接種到BGLB肉湯培養基中，每個(gè)稀釋度接種三管。

　　b)置BGLB肉湯管于36℃±1℃培養48±2h。記錄所有BGLB肉湯管的產(chǎn)氣管數。

　　c)結果報告：按BGLB肉湯管產(chǎn)氣管數，查MPN表報告每25cm2食品接觸面中或每只手的大腸菌群值。

　　3.2.3金黃色葡萄球菌檢測

　　(1)定性檢測

　　a) 取1ml稀釋液注入滅菌的平皿內，傾注15-20ml的B-P培養基，(或是吸取0.1稀釋液，用L棒涂布于表面干燥的B-P瓊脂平板)，放進(jìn)36±1℃的恒溫箱內培養48±2小時(shí)。

　　b)從每個(gè)平板上至少挑取1個(gè)可疑金黃色葡萄球菌的菌落作血漿凝固酶實(shí)驗。

　　c) 結果報告：B-P瓊脂平板的可疑菌落作血漿凝固酶實(shí)驗為陽(yáng)性，即報告手(工器具)上有金黃色葡萄球菌存在。

　　(2)定量檢測

　　a) 以無(wú)菌操作，選擇3個(gè)稀釋度各取1ml樣液分別接種到含10﹪氯化鈉胰蛋白胨大豆肉湯培養基中，每個(gè)稀釋度接種三管。

　　b) 置肉湯管于36±1℃的恒溫箱內培養48小時(shí)。劃線(xiàn)接種于表面干燥的B-P瓊脂平板，置36℃±1℃培養45～48小時(shí)。

　　c) 從B-P瓊脂平板上，挑取典型或可疑金黃色葡萄球菌菌落接種肉湯培養基，36℃±1℃培養20～24小時(shí)。

　　d) 取肉湯培養物做血漿凝固酶試驗，記錄試驗結果。

　　e) 報告結果：根據凝固酶試驗結果，查MPN表報告每25 cm2食品接觸面中或每只手的金黃色葡萄球菌值。

　　3.3工廠(chǎng)環(huán)境中病原體的檢測計劃與方法

　　檢測計劃：為了保證食品安全，工廠(chǎng)應該對生產(chǎn)環(huán)境中的病原微生物進(jìn)行檢測和評估，檢測項目包括李斯特菌，沙門(mén)氏菌等病原體微生物，化驗室應該按照一定的計劃對生產(chǎn)場(chǎng)所環(huán)境中的病原體進(jìn)行檢測，其中包括地面、下水道、 排水溝、墻壁、天花板、設備框架、運輸的支架，冷藏裝置、速凍機、傳送帶、設備的螺絲、維修工具等部位。當某個(gè)點(diǎn)檢測到病員微生物時(shí)，應該對環(huán)境中的相似點(diǎn)加大檢測頻率;在把所有的預定點(diǎn)檢測完后，應該對環(huán)境中的病原微生物的存在狀況進(jìn)行全面評估，在下一次環(huán)境檢測循環(huán)過(guò)程中加強檢測容易出現病原體的環(huán)境點(diǎn)，達到持續改進(jìn)的目的。

　　檢測頻率:每月兩次,每次每個(gè)區域至少選取5個(gè)檢測點(diǎn),分別進(jìn)行檢測。

　　3.3.1環(huán)境李斯特菌的檢測方法(3MTM PetrifilmTM環(huán)境李斯特菌的測試片)

　　3.3.1.1用涂抹棒，海綿或者其他采樣設備收集環(huán)境樣本。

　　3.3.1.2將收集的樣本添加10毫升滅菌的緩沖蛋白胨水，將樣本與緩沖蛋白胨混合1分鐘，將樣品置于室溫(20-30℃)1小時(shí)，最久不超過(guò)1.5小時(shí)，以修復損傷的李斯特菌。

　　3.3.1.3將測試片放在平坦處，掀起上層膜。

　　3.3.1.4用移液器垂直滴加3毫升樣品到下層膜中央，將上層膜緩慢蓋下，以免產(chǎn)生氣泡。

　　3.3.1.5輕輕將塑料壓板放在位于接種區上層膜上，不要壓，扭轉或者滑動(dòng)壓板。提起壓板等至少十分鐘，以使膠體凝固。

　　3.3.1.6將測試片透明面朝上，可疊放至十片，在37℃±1℃培養26-30小時(shí)，可以用標準菌落記數器或者其他光學(xué)放大器判讀，不要記數圓形輪廓上的菌落，因為他們不受選擇性培養基的影響。

　　3.3.1.7對于定性檢測，根據紫紅色菌落是否存在，結果記為檢出或者未檢出。

　　3.3.2環(huán)境中沙門(mén)氏菌的檢測方法

　　3.3.2.1采樣地點(diǎn):選取采樣點(diǎn)時(shí)因盡量選取微生物容易滋生的地方

冷凍車(chē)間		FD車(chē)間
東區初加工	傳遞窗口表面、排水溝、 排水溝出口、墻壁、地面	卸料間	墻壁、墻角、地面、天花板、 物料車(chē)表面
東區精加工	地面、墻壁、墻角、排水溝、 排水溝出口、速動(dòng)機鏈條、天花板	暫存間	墻壁、地面、天花板、墻角、墻縫
西區初加工	傳遞窗口表面、地面、墻壁、 排水溝、排水溝出口	挑選間	墻壁、地面、天花板、墻角、墊板
西區精加工	地面、墻壁、墻角、排水溝、排水溝出口、速動(dòng)機鏈條、天花板	包裝室	墻壁、地面、天花板、金探傳送帶表面、落地料存放處

　　3.3.2.2操作步驟

　　3.3.2.2.1采樣應在生產(chǎn)開(kāi)始后進(jìn)行，用已浸潤過(guò)的棉拭在選定的被測表面旋轉涂抹約100cm2的面積，然后將棉拭放回涂抹試管并蓋緊。

　　3.3.2.2.2將樣品帶回實(shí)驗室，每5個(gè)點(diǎn)混合成一個(gè)樣品,登記編號,按照SN0170-92標準及時(shí)檢測，若有陽(yáng)性結果出現，應逐步對所混合的每個(gè)點(diǎn)分別檢測。

　　物體表面涂抹菌落總數計算方式：物體表面細菌總數(cfu/c㎡)=平皿上菌落的平均數*采樣液稀釋倍數/采樣面積(cm2)

　　根椐GB15979-2002《一次性衛生用品衛生標準》的標準,生產(chǎn)環(huán)境衛生指標

　　1裝配與包裝車(chē)間空氣中細菌菌落總數應≤2 500 cfu/m3。

　　2工作臺表面細菌菌落總數應≤20 cfu/cm2。

　　3.工人手表面細菌菌落總數應≤300 cfu/只手，并不得檢出致病菌。

　　人員和環(huán)境衛生檢測方法

　　一、 空氣采樣及檢驗方法

　　1培養基：普通營(yíng)養瓊脂平板，按GB4789.28中3.7條配制

　　2采樣(空氣沉降法)

　　2.1布點(diǎn)：面積小于30平方米的車(chē)間，設一對角線(xiàn)，在線(xiàn)上取3點(diǎn)，即中心一點(diǎn)，兩端在距墻1米處各取一點(diǎn);面積大于30平方米的車(chē)間，設東、西、南、北、中5個(gè)點(diǎn)，其中東、西、南、北點(diǎn)均距墻1米。

　　2.2采樣高度：與地面垂直高度80-150厘米。

　　2.3采樣方法;用直徑為9厘米的普通營(yíng)養瓊脂平板在采樣點(diǎn)上暴露20分鐘蓋上送檢培養。

　　3培養：于37℃培養24小時(shí)。

　　4檢測頻率：每周

　　空氣質(zhì)量標準：

　　生車(chē)間、熟車(chē)間、成品車(chē)間：低于100個(gè)

　　半成品庫、成品庫：低于10個(gè)

　　二、設備的采樣與檢驗方法

　　根據生產(chǎn)過(guò)程所要求的重點(diǎn)衛生部位，實(shí)驗室對其進(jìn)行涂抹采樣，進(jìn)行細菌總數檢驗。

　　1采樣方法

　　1.1涂抹法(適用于表面平坦的設備和工器具產(chǎn)品接觸面)

　　取經(jīng)過(guò)滅菌的鋁片框(框內面積為50平方厘米)放在需檢查的部位上，用無(wú)菌棉球蘸上無(wú)菌生理鹽水擦拭鋁片中間方框部分，擦完后立即將棉球投入盛有10毫升無(wú)菌生理鹽水的試管中，此液每毫升代表5平方厘米。

　　1.2貼紙法(適用于表面不平坦的設備和工器具接處面)

　　將無(wú)菌規格紙(5×5厘米，紙質(zhì)要薄而軟)用無(wú)菌生理鹽水泡濕后，于需測部分分別貼上兩張，兩張紙面積共50平方厘米，然后取下放入盛有10毫升無(wú)菌生理鹽水的試管中，此液每毫升代表5平方厘米。

　　2檢驗方法

　　2.1細菌總數的檢驗

　　將上述樣液充分振搖，根據衛生情況，相應地做10倍遞增稀釋?zhuān)x擇其中2-3個(gè)合適的稀釋度作平皿傾注培養，培養基用普通營(yíng)養瓊脂，每個(gè)稀釋度作2個(gè)平皿，每個(gè)平皿注入1毫升樣液，于37℃培養24小時(shí)后計菌落數。

　　結果計算

　　表面細菌總數(cfu/cm2)=平皿上菌落的平均數×樣液稀釋倍數/30×2

　　2.2致病菌的檢驗

　　沙門(mén)氏菌，參照GB4789.4進(jìn)行

　　金黃色葡球菌，參照GB7918.5進(jìn)行

　　4.檢驗合格標準：細菌總數10-100個(gè)∕cm2，

　　5.關(guān)鍵點(diǎn)：細菌總數≤10個(gè)∕cm2

　　一般區域：細菌總數≤100個(gè)∕cm2

　　三、人員手表面細菌污染情況的檢驗

　　1. 采樣方法：用一支蘸有無(wú)菌生理鹽水的棉拭子涂擦被檢對象手的全部，反復兩次，涂擦的時(shí)候棉拭子要相應地轉動(dòng)，擦完后，將手接觸部分剪去，將棉拭子放入裝有10毫升無(wú)菌生理鹽水的試管內送檢培養。

　　2. 檢驗方法：同工器具表面細菌總數檢驗方法。

　　3. 結果計算：每只手表面的細菌總數(cfu/只手)=平皿上菌落的平均數×樣液稀釋倍數

　　四、消毒液藥效的微生物學(xué)鑒定法

　　1采樣對象：正常使用的消毒液，和已知配制好備用的消毒液

　　2采樣及檢驗方法

　　在無(wú)菌條件下，用無(wú)菌吸管吸取1毫升樣液，加入9毫升稀釋液中混勻，對于醇類(lèi)與酚類(lèi)消毒劑，稀釋液用普通營(yíng)養肉湯即可;對于含氯消毒劑、含碘消毒劑，需在肉湯中加入0.1%硫代硫酸鈉，對洗必泰、季銨鹽類(lèi)消毒劑，需在肉湯中加入3%(W/V)土溫80和0.3%卵磷脂;對醛類(lèi)消毒劑，需在肉湯中加入0.3%甘氨酸;對于含有表面活性劑的各種復方消毒劑，需在肉湯中加入(W/V)土溫80，以中和被檢樣液中的殘效作用，

　　將注入了樣液的稀釋液充分搖勻，取1毫升注入平皿，隨之倒入普通營(yíng)養瓊脂，待瓊脂凝固后，翻轉平皿，將平皿于37℃條件下培養24小時(shí)后計平板上生長(cháng)的菌落數。

　　3結果分析

　　平板上有菌生長(cháng)，表明被檢樣液中有殘存活菌，若每個(gè)平板菌落數在10個(gè)以下，仍可用于消毒，若每個(gè)平板菌落數超過(guò)10個(gè)，說(shuō)明每毫升被檢樣液含菌量已超過(guò)100個(gè)，即不宜在用于消毒。

　　該公式是一個(gè)經(jīng)驗公式.它的理論模式依據是:100CM2的面積上10MIN降落的菌落數,

　　等于1升空氣中所含的細菌總數.系數50000基于上述假說(shuō)和單位換算而來(lái).

　　細菌總數(CFU/M3)=5/10T*100/A*1000*N=50000*N/AT

　　5/10T:實(shí)際放置了5MIN;

　　100/A:A單一培養皿面積;

　　1000:1M3=1000L啊,換算成m3

　　1、空氣細菌落菌數單位既然是cfu/m3，那采樣時(shí)應該還要記錄放置平皿的高度。

　　2、食品安全管理體系中罐頭行業(yè)有個(gè)標準如下：

　　落下菌數 空氣污染程度 評價(jià)

　　30以下 清潔 安全

　　30～50 中等清潔

　　50～70 低等清潔 應加注意

　　70～100 高度污染 對空氣要進(jìn)行消毒

　　100以上 嚴重污染 禁止加工

　　3、是否可根據企業(yè)相應的加工產(chǎn)品微生物指標進(jìn)行自行制定?