1　飼料中有害微生物快速檢測方法研究進(jìn)展

　　1.1　生物傳感器技術(shù)

　　生物傳感器（biosensor）是指對生物物質(zhì)敏感并能將其濃度轉換為電信號進(jìn)行檢測的儀器；生物傳感器又分為：酶生物傳感器、微生物傳感器和免疫傳感器。它們具有成本低、體積小、靈敏度較高的優(yōu)點(diǎn)；能從腐敗或者半腐敗的食品、飼料中得到實(shí)時(shí)而快速、多樣化的分析檢測結果。

　　張杰等利用生物素——親和素系統將分子馬達與探針連接構建了F0F1——ATPase分子馬達生物傳感器，它能對副溶血性弧菌特異性識別，最低檢測限為1pg／反應體系，對其致病性進(jìn)行快速診斷，無(wú)需熱循環(huán)反應，檢測周期縮短，整個(gè)分析過(guò)程只需1h——2h，不需酶切及電泳等繁瑣操作。

　　張捷等通過(guò)生物素——親和素系統將特異性沙門(mén)氏菌特異性基因（invA，作為其目的基因片段）核酸探針連接在F0F1——ATPase的ε亞基上構建生物傳感器；將待測樣品和陰性對照分別與生物傳感器結合后，比較其催化三磷酸腺苷（ATP）合成30min后的ATP產(chǎn)生量，依此對樣品中的沙門(mén)氏菌DNA進(jìn)行檢測。該方法對沙門(mén)氏菌DNA的檢測時(shí)間為1h，檢出限為10ng／ml。從分析樣本分離得到的30株細菌，利用分子馬達生物傳感器的檢測結果與PCR

檢測的結果一致。

　　Kim等為了提高傳感器對單增李斯特菌的分析檢測能力，設計了與實(shí)時(shí)的分析系統相連結的IMC模塊（immuno——magnetic concentration）。生物傳感器技術(shù)大大縮短了檢測時(shí)間，可在數小時(shí)甚至數分鐘內查出致病微生物，為微生物的快速檢測提供了一種有效的工具。但該法在預處理方面受到某些限制。

　　1.2　基因芯片技術(shù)

　　基因芯片技術(shù)是在生命科學(xué)領(lǐng)域迅速發(fā)展的新型食源性檢測技術(shù)。該法把微電子光刻技術(shù)與DNA化學(xué)合成技術(shù)相結合，大大提高了基因芯片的探針密度，且試劑用量減少，可以實(shí)現標準化和批量化大規模生產(chǎn)，有很大的發(fā)展潛力。將基因芯片技術(shù)與其它技術(shù)結合起來(lái)，能達到更好的效果。

　　戈海澤等根據生物信息學(xué)技術(shù)以細菌16SrDNA和23SrDNA序列設計各細菌的特異型探針和引物，在基因芯片制備基礎上，通過(guò)對靶基因的擴增、雜交和對雜交結果的分析，對常見(jiàn)腸道致病菌的檢測和鑒定效果進(jìn)行評價(jià)，同時(shí)對臨床采集100份腹瀉患者糞便標本進(jìn)行細菌培養。在100份臨床糞便標本中，采用基因芯片技術(shù)共檢出50份（50％）攜帶腸道致病菌；細菌培養鑒定出47份（47％）攜帶腸道致病菌，其中42份基因芯片與細菌培養結果一致，準確率為79.25％，與細菌培養結果比較差異無(wú)統計學(xué)意義（P＞0.05）。該該法具有高通量、高準確性和高靈敏度，檢測時(shí)間短，可同時(shí)檢測多種有害微生物，可以作為臨床鑒定細菌的一個(gè)重要的方法。將廣泛應用于食品飼料安全控制，突發(fā)性食品安全事件檢測，出入境檢驗檢疫等，但檢測費用昂貴。

　　1.3　聚合酶鏈式反應技術(shù)

　　聚合酶鏈式反應（PCR）是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段，具有特異性強、靈敏度高、簡(jiǎn)便快速和對標本的純度要求低等優(yōu)勢；不過(guò)檢測樣品較多時(shí)工作量大。在食品安全越來(lái)越嚴峻的形式下，許多科技工作者試圖多種檢測方法聯(lián)用，達到解決上述問(wèn)題的目的。將多種檢測方法聯(lián)用，旨在彌補單一檢測方法的局限性。目前國際上研究的熱點(diǎn)有多重熒光實(shí)時(shí)PCR檢測技術(shù)，兼具多重PCR和熒光實(shí)時(shí)PCR技術(shù)的實(shí)時(shí)定量檢測監控PCR產(chǎn)物兩方面的優(yōu)點(diǎn)。

　　石建玲等根據幽門(mén)螺桿菌23SrDNA序列設計引物和探針，構建質(zhì)粒標準品，建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系并進(jìn)行方法學(xué)評價(jià)，對2012——05——10收集的100份臨床樣本進(jìn)行檢測并同時(shí)應用免疫組化及銀染方法進(jìn)行比較分析發(fā)現：檢測范圍寬，在107copies／l——102copies／l（指1l溶液里面DNA／RNA的拷貝數是多少個(gè)）內均呈現良好的線(xiàn)性關(guān)系，且相關(guān)系數為1；與多種細菌均無(wú)交叉反應，特異性好；檢測時(shí)間短，整個(gè)PCR反應過(guò)程僅需70min；并可在不同拷貝數的標準品批內重復測定，對臨床其它消化道病原體不出現特異性的擴增曲線(xiàn)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有靈敏度和特異性高及重復性好等優(yōu)點(diǎn)。國外也有將酶聯(lián)免疫吸附測定與PCR技術(shù)聯(lián)用建立有害微生物檢測方法的報道，有效的提高了有害微生物的檢出率。

　　1.4　生物阻抗法

　　生物阻抗法的原理是利用由微生物新陳代謝引起的培養基電學(xué)特性變化快速檢出樣品中微生物的含量。阻抗法具有能區分活細胞和死細胞的優(yōu)勢，而死細胞常常無(wú)致病性，保障食品與飼料安全的關(guān)鍵就是檢驗活細胞的數量。陳江利用阻抗法檢測啤酒有害乳酸菌，630A培養基（奧地利SY——LAB公司）較適合于阻抗法，用E值作為阻抗值變化的判斷標準，與傳統培養基法檢測結果相比，阻抗法的檢測結果準確可靠，能夠將檢測時(shí)間縮短至72h。此法檢測速度很快，但只能確定污染程度。

　　1.5　蛋白質(zhì)芯片技術(shù)

　　蛋白質(zhì)芯片技術(shù)又稱(chēng)蛋白質(zhì)（微）陣列，是指將已知的大量蛋白質(zhì)（如酶、抗原、抗體、受體、配體、細胞因子等）固定在經(jīng)化學(xué)修飾的固相載體（璃片、硅片等）上，在保留蛋白質(zhì)物化性質(zhì)的基礎上，蛋白質(zhì)與載體表面結合，再用激光掃描系統或者電感耦合器件獲取相關(guān)圖像；然后用專(zhuān)門(mén)的計算機軟件分析圖像、定性定量結果。Howell等采用俗稱(chēng)軟蝕刻的微接觸印刷技術(shù)（microcontact printing，CP）制作出了一種可以檢測大腸桿菌E。coli O157∶H7及鮭腎桿菌（renibacterium salmoninarum）的抗體微陣列，結果表明：此芯片與其他有害微生物的交叉反應少， 檢出濃度為7×107cfu／ml，檢測時(shí)間是40min，是一種很有效的微生物檢測方法。

　　方珍建立了檢測E。coli O157∶H7的液相蛋白芯片方法。通過(guò)繪制檢測曲線(xiàn)，分別應用該方法及H2O作溶解劑的液相芯片方法檢測實(shí)際牛肉樣品。比較該方法與細菌分離培養法的陽(yáng)性檢出率，能檢出陽(yáng)性的最低濃度為103cfu／ml（増菌后），最低檢出限為100cfu／ml；與18種腸道菌無(wú)交叉反應，特異性良好；3次重復實(shí)驗，批間變異系數7.61，重復性良好；應用該方法檢測牛肉樣品中人工添加細菌，能檢出陽(yáng)性的最低濃度為0.5cfu／ml（增菌前）；應用該方法檢測154份實(shí)際牛肉樣品，檢出陽(yáng)性樣品19份，而細菌培養法檢出陽(yáng)性樣品16份。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是一種高特異性、高靈敏度、高通量、重復性好、應用性強、適用范圍廣且微型化的分析技術(shù)，在生命科學(xué)的各個(gè)研究領(lǐng)域有很好的發(fā)展前景，但同基因芯片技術(shù)一樣，檢測費用高，發(fā)展還不成熟。

　　1.6　納米金標記技術(shù)

　　納米金標記技術(shù)是指直徑在1nm——100nm金的微小顆粒，具有高電子密度，介電特性和催化作用，可以與多種生物大分子結合，且不影響生物大分子的生物活性。近年來(lái)，基于納米金標記的快速檢測研究在有害微生物方面應用比較多，檢測的微生物種類(lèi)也比較多，國內外科技工作者通過(guò)對納米金顆粒表面特性的處理以及在納米金顆粒表面標記上特定的寡核苷酸探針，開(kāi)發(fā)研究出了新的微生物檢測系統。

　　劉霞利用氨基偶聯(lián)法在傳感器表面固定多克隆抗體（PAb）作為一抗，金納米粒子（AuNPs）標記的大腸桿菌E。coli O157∶H7的多克隆抗體（PAb）作為二抗，通過(guò)三明治方法用雙通道表面等離子體共振（SPR）傳感器對E。coli O157∶H7進(jìn)行檢測。SPR直接法檢出限為103cfu／ml，線(xiàn)性范圍為103cfu／ml——109cfu／ml；金納米粒子增強三明治法的檢出限為10cfu／ml，線(xiàn)性范圍為10cfu／ml——1010cfu／ml，靈敏度提高100倍，檢測范圍更寬，檢測時(shí)間縮短，選擇性和重現性較好。此技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、特異性強、價(jià)廉、樣品所需量少等優(yōu)點(diǎn)，適合現場(chǎng)篩選，在飼料檢測中有著(zhù)廣泛的應用價(jià)值和發(fā)展前景。

　　2　飼料中有害微生物快速檢測設備

　　目前，生物學(xué)領(lǐng)域的專(zhuān)家通過(guò)對微生物快速檢測方面深入的研究，開(kāi)發(fā)了一系列技術(shù)，有ATP熒光儀、多功能微生物熒光檢測儀、微生物實(shí)時(shí)光電檢測系統、紙片法。這些用于食品中有害微生物的快速檢測技術(shù)，未來(lái)同樣可以在飼料中應用，這些方法的應用將為飼料安全提供有力的保障，同時(shí)可以促進(jìn)我國飼料工業(yè)的持續健康發(fā)展。下面重點(diǎn)介紹常用的兩種有害微生物快速檢測設備。

　　2.1　RVLM 型微生物快速檢測系統

　　由德國皇家生物科技公司生產(chǎn)的高性能便攜式微生物檢測儀將多種檢驗方法的優(yōu)點(diǎn)集合應用，如培養皿法、酶法（β——葡萄糖苷酸酶分析）、免疫法（抗原搜尋）、基因法（基因搜尋），具有便捷、操作簡(jiǎn)單、檢驗迅速、高靈敏性、高特異性、消耗成本低、定性半定量測量等諸多優(yōu)點(diǎn)。

　　2.1.1　快速檢測對象

　　活菌總數、大腸菌群、大腸桿菌、腸道桿菌科、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門(mén)氏菌、李斯特菌、腸球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、亞硫酸鹽還原梭狀芽孢桿菌、霉菌（曲霉屬真菌、曲霉菌）、酵母菌、軍團菌等，可以定量檢測。

　　2.1.2　快速檢測產(chǎn)品特點(diǎn)

　　應用范圍廣：應用于食品、飼料、藥品、水質(zhì)、空氣微生物檢測等眾多領(lǐng)域，可檢測固態(tài)、液態(tài)、氣態(tài)及膏狀、漿狀等多種樣本。

　　使用方便：一套便攜系統即可完成采樣、實(shí)驗、后處理等工作，無(wú)需配備多種檢測儀器。

　　操作簡(jiǎn)單：檢測樣本只需1ml或1g，且無(wú)需前處理，只需3個(gè)步驟就可完成操作。

　　高靈敏度：可檢測到數量級為1cfu的目標微生物，滿(mǎn)足國內國際微生物檢測標準。

　　高特異性：特異性高達99.999％，杜絕非目標微生物造成的實(shí)驗干擾。

　　準確度高：可100％定量分析。

　　檢測數量：8個(gè)插槽可同時(shí)提供8項不同實(shí)驗，13類(lèi)不同標準培養環(huán)境。

　　快速檢測：最快10min即可得到檢測結果，可用于現場(chǎng)檢測。

　　高智能化：能夠自動(dòng)控制孵育溫度和孵育時(shí)間，并可自動(dòng)生成實(shí)驗報告。

　　全自動(dòng)化：獨立、持續地檢測并記錄瓶中的微生物數量（cfu）。

　　在歐洲的實(shí)驗室中，80％——90％的微生物檢測實(shí)驗采用的儀器是RVLM 型微生物檢測系統，其超高的靈敏度可以滿(mǎn)足歐盟及國內檢測標準。RVLM型微生物快速檢測是目前業(yè)內最高端的智能優(yōu)質(zhì)微生物檢測儀。