實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(FQ-PCR)實(shí)現了PCR從定性到定量的飛躍，可對目標DNA分子起始拷貝數精確定量。因其檢測方法精確、靈敏、污染途徑少，已成為國際公認的核酸分子定量的標準方法，在食品中安全微生物的鑒定也有重要應用[1]。沙門(mén)氏菌是引起食物中毒最為常見(jiàn)的致病菌，因此，建立食品中沙門(mén)氏菌中熒光定量PCR檢測方法有重要的研究意義。材料與方法 1菌株：鼠傷寒沙門(mén)氏菌(C77-31)有中科院微生物所提供，肉類(lèi)、奶制品等產(chǎn)品均購于農產(chǎn)品市場(chǎng)。2主要試劑和設備：DNA提取試劑購買(mǎi)于美國Invitrogen公司;Taq酶和緩沖液購買(mǎi)于日本TaKara;opction2熒光定量PCR購買(mǎi)于美國MJ公司;超速離心機購買(mǎi)于Eppendorf;細菌鑒定儀;所用的常規試劑均為分析純，購買(mǎi)于國藥化學(xué)試劑有限公司;方法，將標準菌株在XLD、三糖鐵斜面和肉湯培養基上培養，從肉湯培養基中取一定量的菌液裝入EP管中，離心，去上清，加入雙蒸水，沸水浴、冰水浴，離心，取上清。食品樣品采用沙門(mén)氏菌國標檢測法(GB 4789.4-2010)中BPW前增菌之后的培養液裝入EP管中，進(jìn)行相同的操作。引物探針設計，在NCBI上搜索到目的基因，找到該基因的mRNA，在CDS選項中，找到編碼區所在位置，在下面的origin中，Copy該編碼序列作為軟件查詢(xún)序列的候選對象，然后用PrimerPremier5搜索引物和用Oligo驗證評估引物。經(jīng)過(guò)篩選進(jìn)行特異性和靈敏度的實(shí)驗。

　　表1 引物和探針序列

　　名稱(chēng) 序列 位置 Tm值(℃)

　　上游引物 CCCCTTTTCAATCCACAAA 450-473 57.2

　　下游引物 CCCCTTTTCAATCC 502-530 58.6

　　探針 FAM-AAACGTACCGCTGCA 66.3

　　實(shí)時(shí)熒光PCR反應體系與反應條件

　　分別考察了不同Taq酶用量，Mg2+濃度、引物濃度和探針濃度對所提取的核酸進(jìn)行擴增的影響。同時(shí)對循環(huán)條件也進(jìn)行了優(yōu)化。靈敏度實(shí)驗，將沙門(mén)氏菌按照上述的培養條件進(jìn)行培養，測量OD后估算菌數，然后稀釋、涂板確定菌密度，然后用熒光定量PCR進(jìn)行檢測。

　　特異性實(shí)驗，將沙門(mén)氏菌與其他的食品致病菌共同進(jìn)行特異性實(shí)驗，做陽(yáng)性對照實(shí)驗并用國標法進(jìn)行驗證。

　　結果與分析

　　反應體系的優(yōu)化 1Taq酶的優(yōu)化，考察了不同的酶量(0.5至2.5U，每個(gè)梯度為0.5)對陽(yáng)性模板的Ct值的影響，陽(yáng)性模板Ct值為23.1-23.95之間變化，其影響并不大，當酶量為2.5U時(shí)，整個(gè)反應體系的熒光量最高。2Mg2+濃度的有優(yōu)化，從表2中可以看出，不同的Mg2+濃度對陽(yáng)性模板的Ct的影響并不大，當酶量為3.5U時(shí)，整個(gè)反應體系的熒光量最高，因此，后續實(shí)驗也選用該濃度作為最佳濃度。

　　表2 Mg2+濃度對陽(yáng)性模板的Ct值的影響

　　1.25mmol/L 2.0mmol/L 2.75mmol/L 3.5mmol/L

　　Ct值 24.05 24.25 25.25 26.21

　　3引物探針量的優(yōu)化，分別選擇了引物濃度0.25，0.5，0.75和1.0µmol/L，探針的濃度分別為0.125，0.5，0.75和1.0µmol/L，并以不同的濃度的引物和探針濃度配比，對提取的核酸進(jìn)行PCR擴增。研究結果表明當引物濃度為0.75µmol/L，探針濃度為0.5µmol/L時(shí)熒光效率最高，因此，該濃度作為最佳條件。4循環(huán)條件的優(yōu)化，在第一輪循環(huán)前，在94℃下變性5-10min非常重要，它可使模板DNA完全解鏈。退火是PCR的一個(gè)關(guān)鍵參數。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結合。實(shí)際上，引物延伸在退火時(shí)即已開(kāi)始，因為T(mén)aqDNA聚合酶的作用溫度范圍可從20℃-85℃，延伸反應時(shí)間的長(cháng)短取決于目的序列的長(cháng)度和濃度[3]。從表4中可以看出延伸時(shí)溫度為60℃較好。

　　表3 循環(huán)條件的優(yōu)化

　　變性 退火 延伸 循環(huán)次數 Ct值

　　條件1 95℃，2min 95℃，5s 60℃，40s 40 26.74

　　條件2 95℃，2min 95℃，5s 55℃，10s 40 25.47

　　特異性檢測

　　對50份食品分別按照熒光定量PCR、國標法對沙門(mén)氏菌進(jìn)行檢測，熒光定量PCR的陽(yáng)性數為9，國標法為8，其陽(yáng)性率分別為18%和16%。雖然兩種方法的差異并不顯著(zhù)，但是熒光定量PCR檢出數相對偏高，檢測時(shí)間上大大降低。這是由于熒光定量PCR使用特異性探針對定量分子進(jìn)行識別，具有很高的準確性。同時(shí)，靶序列由引物和探針雙重控制，特異性好、假陽(yáng)性低。靈敏度檢測，熒光PCR檢測技術(shù)是綜合了PCR技術(shù)、熒光標記技術(shù)、激光技術(shù)、數碼顯象技術(shù)為一體的技術(shù)，因此它的檢測靈敏度很高。按Ct值不大于35.0判斷為陽(yáng)性，建立的方法檢測靈敏度可達100CFU/ml。

　　表4 各濃度熒光定量PCR的檢測結果

　　106 105 104 103 102 50

　　Ct值 22.12 24.01 28.12 31.12 34.25 37.12

　　通過(guò)對熒光定量PCR的反應條件和循環(huán)體系條件進(jìn)行優(yōu)化，本研究建立的熒光定量PCR檢測方法特異性和靈敏度都較高，克服了普通PCR的缺點(diǎn)，為食品中致病微生物的定量研究提供了理論和實(shí)踐的借鑒意義。