液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定火鍋食品中罌粟堿等非法添加劑含量的不確定度評定     1 引言
    罌粟殼是成熟罌粟果去籽后的部分，屬于國家管制藥品，但因其具有調味的功能，所以被一些不法商販用于火鍋、面湯、酸辣粉、鹵制品等食品中。罌粟殼中主要成分有罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因和蒂巴因等^[1]，長(cháng)期食用容易上癮，過(guò)量攝入可能引起心律不齊，甚至導致死亡^[2]。因此，準確檢測食品中罌粟堿等非法添加劑含量，對于維護人民身體健康、打擊非法添加現象具有重要的意義。測量不確定度表征合理地賦予被測量之值的分散性^[3]，對檢測結果的可信性有著(zhù)重要意義。
    本文以罌粟堿為例對液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定火鍋食品中非法添加劑含量的不確定度進(jìn)行了評定，計算了測定結果的合成不確定度和擴展不確定度，為評價(jià)檢測結果提供了理論依據。
    2 材料與方法
    2.1 儀器與試劑
    Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀；TSQ Quantiva MS三重四級桿質(zhì)譜儀（Thermo fisher）；配加熱電噴霧離子源（H-ESI）；XP204型電子天平（METTLER TOLEDO）；超聲波清洗機（德國Elma-P120H）；高速離心機（德國Sigma）；WH-861渦旋混合器（南京諾泰施格科學(xué)儀器有限公司）；罌粟堿等非法添加劑混合標準溶液（罌粟堿濃度10μg/mL，安譜公司）；乙腈、甲醇、甲酸（色譜純，美國天地有限公司）。
    色譜柱：Phenomenex C18(4.6mm×100mm，2.6μm)；流動(dòng)相A為含0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為甲醇，梯度洗脫條件：0~2min:90%A；2~3min:90%A~10%A；3~7min:10%A；7~8min:10%A~90%A；8~10min:90%A；流速0.5mL/min，進(jìn)樣量10μL，柱溫35℃。
    質(zhì)譜條件：H-ESI；正離子模式；選擇反應監測（SRM）掃描模式；噴霧電壓3.5kV；毛細管溫度350℃，離子源溫度350℃，鞘氣（N₂）流速4.58L/min，輔助氣（N₂）流速7.97L/min。
    2.2 實(shí)驗方法^[4]
    稱(chēng)取樣品5g于50mL聚乙烯離心管中，加入5mL水，振搖使分散均勻，加入15mL乙腈，渦旋振蕩1min，加入6g無(wú)水硫酸鎂/1.5g無(wú)水醋酸鈉的混合粉末（Waters公司），迅速振搖，渦旋振蕩1min，以4000轉/分鐘離心5min。取上清液1.5mL于DisQuE的凈化管（150mg無(wú)水硫酸鎂/50mgPSA/50mg C18，Waters公司），渦旋混合1min，以10000轉/分鐘離心2min，移取上清液，0.22μm濾膜過(guò)濾，取濾液待測。
    2.3 數學(xué)模型
    根據樣品測試方法建立的不確定度評估模型如下：
 
    式中：ω—試樣中罌粟堿的含量（μg/kg）；C—試樣溶液中罌粟堿的濃度（ng/mL）；V—定容體積（mL）；M—試樣質(zhì)量（g）。
    3 不確定度的分析與評定
    3.1 測量重復性引入的不確定度U_rel(X)
    采用A類(lèi)方法評定測量重復性引入的不確定度，評定結果已涵蓋了各步驟的重復性及樣品前處理中各因素的影響。
在相同的條件下，取一陽(yáng)性樣品采用相同的方法平行測試10次，測試結果如表1所示：

    按A類(lèi)評定，測量重復性引入的標準不確定度和相對不確定度分別為：     3.2 樣品稱(chēng)量引入的不確定度U_rel(M)
    稱(chēng)量不確定度主要來(lái)自天平校準引入的不確定度。校準證書(shū)表明最大允許誤差0.1mg，按均勻分布，則有標準不確定度：     稱(chēng)量5.0000g樣品，其相對標準不確定度為：     3.3 樣品溶液定容引入的不確定度U_rel(V)
    樣品溶液定容體積為15mL，用1~10mL移液器分兩次移取乙腈，每次7.5mL。
  （a）體積：校準證書(shū)提供允許誤差0.015mL，按均勻分布：   （b）溫度：溫度變化范圍±5℃，按均勻分布：     3.4 樣品溶液濃度測量引入的不確定度U_rel(C)
    樣品溶液濃度測量的不確定度主要來(lái)自：標準物質(zhì)純度、標準儲備液配制、標準溶液配制及儀器等方面。該方法采用的測試儀器為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，靈敏度很高，綜合穩定性的不確定度已在測量重復性中體現，因此這里不再評定儀器引入的不確定度。
    3.4.1 標準物質(zhì)純度引入的不確定度
    標準物質(zhì)純度不低于98%，引入的不確定度按均勻分布計算：     3.4.2 標準儲備液配制過(guò)程引入的不確定度
    將混合標準溶液（1mL）全部移至10mL容量瓶中，乙腈定容得到含罌粟堿1μg/mL的混合標準儲備液。10mL容量瓶校準證書(shū)提供的擴展不確定度為0.02mL，按照3.3計算方法，標準儲備液配制過(guò)程引入的不確定度為：     3.4.3 標準溶液配制過(guò)程引入的不確定度
    移取500μL混合標準儲備液，用乙腈定容于10mL容量瓶，得到含罌粟堿50ng/mL的混合溶液，再分別移取該溶液100μL、400μL、1mL、2mL、3mL，乙腈定容至10mL，得到含罌粟堿0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL的標準曲線(xiàn)溶液。該過(guò)程中移取100μL、400μL、500μL、1mL、2mL、3mL溶液各一次，10mL容量瓶定容6次。
    按照3.3計算方法，標準溶液配制過(guò)程引入的不確定度分量列于表2，合成不確定度為：     3.4.4 樣品溶液濃度測量引入的相對標準不確定度     3.5 回收率引入的不確定度
    測量回收率結果如表3所示：     按A類(lèi)評定，回收率引入的標準不確定度和相對標準不確定度分別為：     3.6 合成不確定度和擴展不確定度
    不確定度分量如表4所示：     合成不確定度為：     取置信概率P=95%，則k=2，則擴展不確定度為：     最終測定結果含量表達為：8.78±0.406(μg/kg)。
    4 結論
    本文較全面地考慮了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定火鍋食品中罌粟堿等非法添加劑含量的不確定度來(lái)源，計算各不確定度分量、合成標準不確定度和擴展不確定度。評定結果表明，測量重復性和樣品溶液濃度測量所引入的不確定度相對較大，其中標準溶液配制過(guò)程和標準物質(zhì)純度對合成不確定度所做的貢獻最大，這對今后的檢測具有實(shí)際指導意義，可選購純度更高的標準物質(zhì)及精密度更高的移液器，設計更合理的標準溶液配制方法，不斷提高操作人員的熟練程度，從而減小測量不確定度，提高測量結果的質(zhì)量。
    參考文獻：
    [1] 戴維杰，鈕偉民.高效液相色譜法檢測摻罌粟殼食品中的罌粟堿[J].中國衛生檢驗雜志，2003,10(5):607-608.
    [2] 皮立，胡鳳祖，師治賢.高效液相色譜-熒光檢測法測定罌粟籽和火鍋湯料中的罌粟堿[J].色譜，2005,23(6): 639-641.
    [3] 王承忠.測量不確定度原理及在理化檢驗中的應用[J].理化檢驗-物理分冊，2003,39(7):382-386.
    [4] 楊雯筌，殷耀，張睿，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定火鍋底料中罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因和蒂巴因等五種非法添加物[J].環(huán)境化學(xué)，2016,35(6):1321-1324.