任嘉瑜1,2，范 娜1*，彭曉邦1,2

(1.商洛學(xué)院健康管理學(xué)院，陜西商洛 726000;

2.陜西“四主體一聯(lián)合”秦嶺健康食品配料及核桃產(chǎn)業(yè)技術(shù)校企聯(lián)合研究中心，陜西商洛 726000)

摘 要：本研究以商洛枳殼為原料，通過(guò)單因素試驗和正交試驗，對枳殼橙皮苷提取工藝參數進(jìn)行優(yōu)化。結果表明，枳殼橙皮苷最佳提取工藝參數為：乙醇濃度70%、料液比1∶6、提取時(shí)間3.5 h、提取溫度65 ℃，提取次數2次，橙皮苷提取率為5.72%。該方法提取率較高，重復性好，工藝簡(jiǎn)單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：正交試驗;提取工藝;枳殼;橙皮苷

枳殼為蕓香科植物酸橙( L.)及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)，盛產(chǎn)于江西、福建、陜西等地，富含黃酮類(lèi)、揮發(fā)油、生物堿及香豆素等多種生物活性物質(zhì)，枳殼黃酮類(lèi)物質(zhì)主要包括柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷和川橙皮素等[1-3]。其中橙皮苷具有抗菌消炎、抗腫瘤、降血壓、抗過(guò)敏、降低膽固醇及改變體內酶活性等廣泛的藥理作用[3-6]。因此，本研究以商洛枳殼為研究對象，采用醇-堿提酸沉淀法，通過(guò)單因素和正交試驗，對枳殼中橙皮苷提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為商洛枳殼的應用擴展、經(jīng)濟價(jià)值的提升及實(shí)現枳殼經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)化提供一定技術(shù)參考。

1　材料與方法

1.1　材料和試劑

商洛枳殼，采自商洛市;蘆丁橙皮苷對照品，購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司：無(wú)水乙醇，氫氧化鈉，鹽酸等均為分析純，購于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2　儀器與設備

HHS型電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫療設備廠(chǎng)出品)、高速萬(wàn)能粉碎機(北京科偉永興儀器有限公司)、DHG-9132A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(北京齊欣科學(xué)儀器有限公司)、H-2050R離心機(長(cháng)沙湘儀離心機儀器有限公司)、電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)、755B紫外可見(jiàn)分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司制造)。

1.3　試驗設計

1.3.1　工藝流程

試驗流程：枳殼→干燥粉碎→水浴提取→過(guò)濾→濾液→酸沉→離心→沉淀→干燥→定容→測吸光度。

1.3.2　操作要點(diǎn)

(1)干燥粉碎。將枳殼在50 ℃干燥恒重，粉碎成粉末狀，每次稱(chēng)取10.0 g，加入錐形瓶中。

(2)水浴提取與過(guò)濾。向錐形瓶中加入不同濃度的pH為13的乙醇溶液，在恒溫水浴鍋中進(jìn)行提取，分別控制時(shí)間t，溫度T，然后靜止冷卻，過(guò)濾，棄去濾渣。

(3)酸沉。用2 mol/L HCl溶液調整濾液pH，直至pH為7，靜置過(guò)夜。

(4)離心與干燥。將酸沉后的濾液用離心機在4 000 r/min，離心5 min，棄去上清液，取出沉淀，然后用無(wú)水乙醇清洗沉淀，直至清洗液無(wú)色，然后在70 ℃恒溫干燥箱進(jìn)行干燥，直至沉淀質(zhì)量不再發(fā)生變化[7-8]。

(5)定容和測吸光度值。準確稱(chēng)取沉淀量為10 mg，用pH為13的堿性無(wú)水乙醇溶液完全溶解后，定容到100 mL的容量瓶中，在287 nm測定其吸光度值，并計算相應的橙皮苷提取率。

1.3.3　枳殼橙皮苷提取工藝優(yōu)化

分別以乙醇濃度(50%、60%、70%、80%和90%)、料液比(1∶2、1∶4、1∶6、1∶8和1∶10)、提取時(shí)間(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h)、提取溫度(50 ℃、60 ℃、70 ℃、

80 ℃和90 ℃)、提取次數(1、2、3、4和5)為主要因素，pH為13的堿性乙醇為提取劑，研究各因素對枳殼橙皮苷提取效果的影響，并根據單因素實(shí)驗結果進(jìn)行正交試驗。

1.3.4　標準曲線(xiàn)的繪制

精密稱(chēng)取橙皮苷標準品10 mg，用pH為13堿性無(wú)水乙醇完全溶解，定容100 mL，得到濃度為100 μg/mL橙皮苷標準溶液。吸取0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL和6.0 mL標準溶液于10 mL試管中，用堿性乙醇稀釋到相應的刻度線(xiàn)，在287 nm波長(cháng)下測定不同濃度標準品吸光度值，以標準品的濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線(xiàn)。

1.3.5　橙皮苷提取率的計算

橙皮苷提取率為提取的橙皮苷的質(zhì)量與原料的質(zhì)量(干重)之比，則提取率可由計算公式獲得。計算公式：

式中：E-橙皮苷提取率;C-樣品濃度(μg/mL);N-樣品稀釋倍數;V-待測樣液體積(mL);M-原料的質(zhì)量(g)。

2　結果與分析

2.1　橙皮苷標準曲線(xiàn)

橙皮苷標準曲線(xiàn)如圖1所示，得到回歸方程：y=0.016 4x-0.002 5，R2相關(guān)系數2=0.999，橙皮苷濃度在10～60 μg/mL范圍內濃度與吸光度值呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2　單因素試驗結果分析

由圖2知，隨乙醇濃度的增大，橙皮苷提取率逐漸增加，當乙醇濃度為70%時(shí)，橙皮苷提取率達到最大。但繼續增加乙醇濃度，橙皮苷提取率反而降低。這可能是由于隨著(zhù)乙醇濃度增大，不利于橙皮苷的溶出，從而使橙皮苷提取率下降。因此，確定乙醇濃度為70%。

由圖3可看出，隨料液比的增大，橙皮苷提取率逐漸增加，當料液為1∶6時(shí)，橙皮苷提取率達到最大。但繼續增加料液比，橙皮苷提取率反而降低。這可能是當料液比較小時(shí)，橙皮苷不能充分溶解，橙皮苷提取率較低，料液比過(guò)大時(shí)，相同溫度條件下需加熱更多液體，所以細胞內部升溫緩慢，導致橙皮苷溶出緩慢，提取率降低。因此，確定料液比為1∶6。

由圖4可看出，隨提取時(shí)間的延長(cháng)，橙皮苷提取率逐漸增大，當提取時(shí)間為3 h時(shí)，橙皮苷提取率最大。但繼續延長(cháng)提取時(shí)間，橙皮苷提取率反而下降。這可能是因為提取

3 h時(shí)橙皮苷已充分溶解于溶劑中，當提取時(shí)間超過(guò)3 h，導致枳殼中其他醇溶性強、親脂性強的雜質(zhì)成分溶出，同時(shí)部分橙皮苷分解，導致橙皮苷提取率下降。因此，確定橙皮苷提取時(shí)間為3 h。

由圖5可看出，隨提取溫度升高，橙皮苷提取率逐漸增加，當提取溫度70 ℃時(shí)，橙皮苷提取率達到最大。但繼續升高溫度，橙皮苷提取率逐漸下降?？赡芴崛囟冗^(guò)高導致橙皮苷變性，膠狀物質(zhì)增加，同時(shí)，提取溫度過(guò)高，導致溶劑蒸發(fā)過(guò)快，且溫度繼續升高，成品顏色發(fā)黑，溶出的非橙皮苷成分增多，導致橙皮苷的提取率下降。因此確定提取溫度為70 ℃。

由圖6可看出，隨著(zhù)提取次數的增加，橙皮苷提取率逐漸增加。但采用二次提取法提取效果增幅相對較高，之后增加提取次數，橙皮苷提取率變化并不明顯，綜合考慮提取時(shí)間和經(jīng)濟因素，確定提取次數為2次。

2.3　正交試驗結果分析

由單因素試驗結果得出乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取溫度(C)、提取時(shí)間(D)4個(gè)因素對橙皮苷提取率影響較大，因此采用正交試驗設計法得出的正交因素及水平如表1所示。由表2中正交試驗結果極差分析得出，對橙皮苷提取率影響順序依次為A(乙醇濃度)>B(料液比)>C(提取時(shí)間)>D(提取溫度)，因素提取溫度對橙皮苷提取率影響較小，且驗證試驗結果表明提取工藝為2232，平均提取率為5.76%，因此從經(jīng)濟成本考慮，選擇水平1，最終確定最佳提取工藝組合為：2231，即乙醇濃度為70%，料液比為1∶6，提取時(shí)間為3.5 h，提取溫度為65 ℃，橙皮苷提取率為5.72%。

3　結論

本研究以商洛枳殼為原料，通過(guò)單因素試驗和正交試驗，優(yōu)化得到橙皮苷最佳提取工藝參數：乙醇濃度為70%、料液比為1∶6、提取時(shí)間為3.5 h、提取溫度為65 ℃，采用二次提取法，橙皮苷提取率為5.72%，該方法提取工藝簡(jiǎn)單，重復性好，工藝穩定。

醇-堿提酸沉淀法主要是利用橙皮苷在堿性條件開(kāi)環(huán)溶解進(jìn)行提取，在酸性條件下閉環(huán)形成沉淀。本研究通過(guò)單因素和正交試驗，對枳殼中橙皮苷提取工藝做了初步研究，較成功地提取得到了橙皮苷。本試驗采用乙醇的堿性溶液進(jìn)行提取，不但環(huán)保、節能，而且提取率相對較高，適合工業(yè)生產(chǎn)。研究結果表明商洛枳殼中含有豐富的橙皮苷生物活性物質(zhì)，具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用前景和價(jià)值。

參考文獻

[1]田芳,何小芳,譚梓君,等.枳殼HPLC特征圖譜及6個(gè)黃酮苷類(lèi)成分含量測定[J].藥物分析雜志,2020,40(6):

1090-1096.

[2]龔斌,李琴,胡小紅,等.枳殼化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].南方林業(yè)科學(xué),2019,47(3):40-45.

[3]李陳雪,楊玉赫,冷德生,等.枳殼化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].遼寧中醫藥大學(xué)學(xué)報,2019,21(2):158-161.

[4]包紹印,許守超,陳天翔,等.基于遺傳神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )的衢枳殼中橙皮苷提取工藝優(yōu)選的研究[J].中藥材,2018,41(11):2632-2635.

[5]龔斌,李琴,胡小紅,等.枳殼化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].南方林業(yè)科學(xué),2019,47(3):40-45.

[6]嚴曉麗,劉曉政,閆倩倩,等.常山縣不同區域衢枳殼中柚皮苷、新橙皮苷含量分析[J].食品工程,2019(4):40-43.

[7]王靈果.柑橘果皮中橙皮苷提取與精制工藝研究[D].石家莊:河北科技大學(xué),2013.

[8]單飛獅,張東鈁,楊敏,等.乙醇-堿液回流法提取紅橘果皮中橙皮苷工藝研究[J].綿陽(yáng)師范學(xué)院學(xué)報,2018,37(2):

66-71.

基金項目：保健食品開(kāi)發(fā)研究團隊(18SCX005)。

作者簡(jiǎn)介：任嘉瑜(1992—)，女，陜西商洛人，碩士，助教。研究方向：食品安全與加工。

通信作者：范娜(1986—)，女，陜西佛坪人，博士，講師。研究方向：功能性食品開(kāi)發(fā)及食品營(yíng)養學(xué)。E-mail: 。