孫玉榮，胡冬梅*，劉 靜，楊文志，王玉玨，江云鵬

(蒙牛乳業(yè)(察北)有限公司 河北省張家口市張北縣察北管理區，河北張家口 076481)

摘 要：目的：探究水解時(shí)間對乳與乳制品中糠氨酸含量測定的影響。方法：在75 ℃、30 min及75 ℃、15 s殺菌條件下測定不同水解時(shí)間下乳與乳制品中的糠氨酸含量，探究其重復性與穩定性。結果：在75 ℃、30 min條件下，隨著(zhù)水解時(shí)間的增加，乳與乳制品中糠氨酸含量有所增加。當水解時(shí)間為9.0 h，乳與乳制品中的糠氨酸含量達到最高，之后緩慢降低。乳與乳制品中的糠氨酸含量的加標回收率均>90%，相對標準偏差<6%。結論：不同水解時(shí)間會(huì )影響到乳與乳制品中的糠氨酸含量。

關(guān)鍵詞：糖氨酸;水解時(shí)間;檢測方法

Effect of Different Hydrolysis Time on Determination of Furosine Content in Milk and Dairy Products

SUN Yurong, HU Dongmei*, LIU Jing, YANG Wenzhi, WANG Yujue, JIANG Yunpeng

(Mengniu Dairy (Chabei) Co., Ltd., Chabei Administrative District Zhangbei County, Hebei Province, Zhangjiakou 076481, China)

Abstract: Objective: To explore the effect of hydrolysis time on the determination of furosine content in milk and dairy products. Method: Determine the content of furosine in milk and dairy products under the conditions of

75 ℃, 30 min and 75 ℃, 15 s under different hydrolysis time, and explore its repeatability and stability. Results: Under the condition of 75 ℃ and 30 min, with the increase of hydrolysis time, the content of furosine in milk and dairy products increased. When the hydrolysis time was 9.0 h, the content of furosine in milk and dairy products reached the highest, and then slowly decreased. The recovery rates of the addition of furosine content in milk and dairy products were both >90%, and the relative standard deviation was <6%. Conclusion: Different hydrolysis time will affect the content of furosine in milk and dairy products.

Keywords: glycine; hydrolysis time; detection method

糠氨酸是牛乳在加熱過(guò)程中，氨基酸、蛋白質(zhì)與乳糖通過(guò)美拉德反應生成ε-N-脫氧乳果糖基-L-賴(lài)氨酸(ε-N-deoxylactolusy-L-lysine)，經(jīng)酸水解轉換成更穩定的糠氨酸(ε-N-2-furoylmethyl-L-lysine，ε-N-2-呋喃甲基-L-賴(lài)氨酸)[1]。這個(gè)反應的大小程度與生乳在滅菌過(guò)程中熱處理的類(lèi)型與強度有著(zhù)密切的聯(lián)系，與成品液態(tài)奶品質(zhì)的優(yōu)良息息相關(guān)。

《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復原乳的鑒定》(NY/T 939—2016)中糠氨酸含量的測定：試樣經(jīng)鹽酸水解后測定蛋白質(zhì)含量，水解液經(jīng)稀釋后用高效液相色譜(HPLC)或超高效液相色譜(UPLC)在紫外(波長(cháng)280 nm)檢測器下進(jìn)行分析，外標法定量[2]?；谒鈺r(shí)間要求(110±2)℃下加熱水解12～23 h。

因耗時(shí)較長(cháng)的原因，本文分析研究水解1～13 h的糠氨酸的回收率，并進(jìn)行回收率試驗，對比分析1～13 h的糠氨酸檢測數據。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

甲醇(CH3OH)：色譜純;濃鹽酸(HCL，密度為1.19 g/mL);三氟乙酸：色譜純;乙酸銨;糠氨酸(C12H17N2O4·XHCL);水相濾膜;水相針頭式濾器;1 mL注射器。

1.2 儀器

配有紫外檢測器的高效液相色譜儀;(110±2)℃干燥箱;密封耐熱試管：容積為20 mL;電子天平：感量為0.1 mg;凱氏定氮儀。

1.3 試驗方法

1.3.1 采樣

用于檢測的巴氏殺菌乳在儲存和運輸過(guò)程中的溫度為2～6 ℃，UHT滅菌乳儲存和運輸溫度不高于25 ℃。按《隨機數的產(chǎn)生及其在產(chǎn)品質(zhì)量抽樣檢驗中的應用程序》(GB/T 10111—2008)的規定取不少于250 mL樣品，樣品在送檢過(guò)程中應完好無(wú)損且樣品儲存環(huán)境條件符合要求。

1.3.2 試樣水解液的制備

吸取2.00 mL試樣，置于密閉耐熱試管中，加入6.00 mL 10.6 mol/L鹽酸溶液，混勻。密閉試管，置于干燥箱中，在110 ℃下加熱水解1～13 h，加熱約1 h后，輕輕搖動(dòng)試管。在加熱結束后，將試管從干燥箱中取出，冷卻后用濾紙過(guò)濾，濾液供測定[2]。

1.3.3 試樣水解液中蛋白質(zhì)含量的測定

移取2.00 mL試樣水解液，按《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》(GB 5009.5—2016)的規定測定試樣溶液中的蛋白質(zhì)含量[3]。

1.3.4 糠氨酸含量的測定原理

試樣經(jīng)鹽酸水解后測定蛋白質(zhì)含量，水解液經(jīng)稀釋后用高效液相色譜(HPLC)或超高效液相色譜(UPLC)在紫外(波長(cháng)280 nm)檢測器下進(jìn)行分析，外標法定量。

1.3.5 試樣水解液中糠氨酸含量測定

移取1.00 mL試樣水解液，加入5.00 mL的6 g/L乙酸銨溶液，混勻，過(guò)0.22 μm水相濾膜，濾液供上機測定。

1.3.6 HPLC測定

(1)色譜參考條件。色譜柱：CAPCELL PAK C18 TYPE：AQ 250 mm×4.6 mm，5 μm粒徑;柱溫：32 ℃;流動(dòng)相：0.1%三氟乙酸溶液為流動(dòng)相A，甲醇為流動(dòng)相B;洗脫梯度，見(jiàn)表1。

(2)糠氨酸含量測定。利用流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的混合液(50∶50)以1 mL/min的流速平衡色譜系統。然后，用初始流動(dòng)相平衡系統直至基線(xiàn)平穩?？瞻自噭?0 µL鹽酸溶液(濃度3 mol/L)，選擇10 μL待測溶液對糠氨酸含量進(jìn)行測量。

其 中：X- 試 樣 中 蛋 白 質(zhì) 的 含 量，g/100 g; V1- 試液消耗硫酸或鹽酸標準滴定液的體積，mL;V2-試劑空白消耗硫酸或鹽酸標準滴定液的體積，mL;C- 硫酸或鹽酸標準滴定溶液濃度，mol/L;0.014 0-1.0 mL硫酸[(c ½H2SO4)=1.000 mol/L]或鹽酸[(c HCl)=1.000 mol/L] 標準滴定溶液相當的氮的質(zhì)量，g;m- 試樣的質(zhì)量，g;V3- 吸取消化液的體積，mL;F- 氮換算為蛋白質(zhì)的系數，各種食品中氮轉換系數;100- 換算系數。

(4)糠氨酸含量的計算?？钒彼岷恳再|(zhì)量分數計，數值以毫克每百克蛋白質(zhì)(mg/100 g蛋白質(zhì))表示，糠氨酸含量的計算如(2)所示：

2 結果與分析

2.1 樣品中糖氨酸含量(mg/100 g蛋白質(zhì))

標樣的濃度為2 mg/L，以標樣的峰面積為儀器采集數據，對樣品中糖氨酸的含量進(jìn)行計算。樣品在乳糖酶作用下，牛乳水解1 h、3 h、5 h、7 h、9 h、11 h和13 h，采用HPLC法對牛乳中糠氨酸含量進(jìn)行測量。作為MailIard反應產(chǎn)生的特定產(chǎn)物，糠氨酸近年來(lái)常常被用于食品受熱程度的判斷與評估，主要應用在谷物、蛋類(lèi)、肉制品及中藥口服液中。由表2可知，隨著(zhù)乳糖酶水解時(shí)間的延長(cháng)，乳與乳制品中糠氨酸含量呈現升高趨勢。經(jīng)過(guò)75 ℃、30 min及75 ℃、15 s預殺菌處理條件下，可以發(fā)現其前者較后者所獲得的糠氨酸含量成倍升高。按照《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復原乳的鑒定》要求，其中的糠氨酸含量>12 mg/100 g蛋白質(zhì)或UHT乳中糠氨酸含量>190 mg/100 g 蛋白質(zhì)，表示含有復原乳。當水解時(shí)間達到9 h后，乳與乳制品中糠氨酸含量>190 mg/100 g蛋白質(zhì)，隨著(zhù)水解時(shí)間的延長(cháng)，糠氨酸含量逐漸降低。乳與乳制品經(jīng)過(guò)75 ℃、15 s熱處理，糠氨酸含量較低，相當于有復原乳的巴氏殺菌乳。

2.2 加標回收率試驗

在已知糠氨酸含量供試驗品中加入一定量標準樣品，反復進(jìn)行5次測定，結果如表3所示。

由表3可知，其回收率均在90%以上。按照公式計算相對標準偏差，結果為：

3 結論

本文對《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復原乳的鑒定》分析步驟中的試樣水解液的制備[3-4]，水解時(shí)間在9 h的糠氨酸含量回收率進(jìn)行分析論證得到，樣品的回收率結果符合回收率要求90%～110%(高效液相色譜法測定復原乳中糠氨酸的含量回收率試驗)[5]，相對標準偏差為5.68，符合獨立測試結果<10%的要求。隨著(zhù)乳糖水解時(shí)間的延長(cháng)，乳與乳制品中糠氨酸含量呈現出升高趨勢，當水解時(shí)間為9 h且經(jīng)過(guò)75 ℃、30 min熱處理，糠氨酸含量>190 mg/100 g蛋白質(zhì)，乳與乳制品相當于含有復原乳的UHT殺菌乳，在75 ℃、15 s條件下，乳與乳制品獲得糠氨酸含量少，僅為含有復原乳的巴氏殺菌乳。按照《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復原乳的鑒定》制備試樣水解液，將水解時(shí)間控制為9 h，獲得的糠氨酸含量最高，且具有較高的回收率，標準偏差<10，故可應用于實(shí)際的檢測工作中，節約人工成本、提高工作效率。

參考文獻

[1]許國慶,趙慧芬,李克杰,等.乳與乳制品中糠氨酸含量的測定方法[J].中國奶牛,2006(7):44-46.

[2]遲驍瑋.乳品中糠氨酸定量分析及熱處理對糠氨酸含量影響的研究[D].淄博:山東理工大學(xué),2012.

[3]盧沛明,黃娟.乳制品中的糠氨酸測定方法的改進(jìn)[J].食品科技2015,40(7):318-320.

[4]王峰恩,張養東,鄭楠,等.奶及奶制品中糠氨酸檢測方法的研究進(jìn)展[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報,2021,12(6):2304-2312.

[5]陳沖沖,鄭楠,文芳,等.牛奶中糠氨酸檢測方法的研究進(jìn)展[J].中國乳品工業(yè),2017,45(4):25-29.