于金英，王 津，全奕潔，汪 冶*

(麗水學(xué)院，浙江麗水 323000)

摘 要：基于多實(shí)驗指標考察優(yōu)化蓮房原花青素超聲波輔助提取工藝。運用正交試驗設計通過(guò)對3個(gè)試驗指標包括蓮房原花青素(LSPC)提取率、低聚蓮房原花青素(LSOPC)提取率、高聚蓮房原花青素(LSPPC)提取率進(jìn)行考察優(yōu)化超聲波輔助提取工藝參數，采用層次分析法(AHP)確立權重確定優(yōu)化工藝。超聲輔助提取優(yōu)化工藝結果為乙醇體積為50%，料液比1∶15，提取4次，提取30 min?；诙鄬?shí)驗指標的優(yōu)化工藝能更加客觀(guān)地反映蓮房原花青素的提取效果。

關(guān)鍵詞：超聲波輔助提取;原花青素;多指標考察;層次分析法

蓮房(蓮蓬)是蓮的成熟花托，是蓮子收獲過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，一般在蓮子采收過(guò)程中被丟棄。蓮房與葡萄籽相似，含有大量原花青素成分，原花青素是由不同數量的兒茶素或兒茶素單體及其聚合體形成的多酚化合物組成的，按照聚合度的不同以及單體的構象或鍵合位置的不同可形成多種化合物，一般分為低聚體OPC(聚合度=2～4)和高聚體PPC(聚合度≥5)。聚合體的抗氧化能力隨著(zhù)聚合度的增大而降低，且低聚體(OPC)較高聚體(PPC)具有良好的生物利用度[1]。為了有效利用蓮房原花青素(Procyanidins Of Lotus Seedpod，LSPC)，本研究利用層次分析法(The Analytic Hierarchy Process，簡(jiǎn)稱(chēng)AHP法)開(kāi)展多指標優(yōu)選的綜合評價(jià)，通過(guò)對3個(gè)實(shí)驗指標：蓮房原花青素(LSPC)提取率、低聚蓮房原花青素(LSOPC)提取率、高聚蓮房原花青素(LSPPC)提取率進(jìn)行綜合評估，可以更加客觀(guān)地反映處州白蓮蓮房中蓮原花青素(LSPC)的提取效率和質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料

處州白蓮蓬購于麗水市蓮都區老竹鎮處州白蓮種植基地，剝除蓮子，將蓮蓬自然陰干。

1.2 儀器與試劑

SG250H超聲波提取器、HX-5FD真空冷凍干燥設備。兒茶素標準品(上海源葉生物科技有限公司)、硫酸、香草醛、甲醇、乙醇。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 蓮房原花青素提取

選用陰干的去除蓮子的干燥蓮房若干，用高速粉碎機粉碎，過(guò)24目篩，稱(chēng)取適量粉末，加入一定量的乙醇，超聲提取，離心過(guò)濾得到提取液。提取液經(jīng)過(guò)薄層旋轉蒸發(fā)儀回收酒精后，剩余水溶液進(jìn)行冷凍干燥處理制備蓮房原花青素(LSPC)樣品。

1.3.2 低聚蓮房原花青素(LSOPC)和高聚蓮房原花青素(LSPPC)樣品制備

利用蓮房原花青素中低聚體和高聚體溶解性差異進(jìn)行分級分離。將上述制備的蓮房原花青素樣品溶于水，首先采用等體積乙酸乙酯萃取3次富集低聚蓮房原花青素，回收溶劑制備低聚蓮房原花青素(LSOPC)樣品，萃取后的水溶液經(jīng)冷凍干燥制備高聚蓮房原花青素(LSPPC)樣品。

1.3.3 蓮房原花青素含量的測定

(1)兒茶素標準曲線(xiàn)的繪制。準確稱(chēng)取兒茶素標準品25 mg，用70%乙醇溶解并定容至25 mL，配制兒茶素標準貯備液1 mg/mL。分別移取兒茶素標準貯備液1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL和5.00 mL至25 mL容量瓶中，加入70%乙醇定容，制備得到濃度為0.04 mg/mL、0.08 mg/mL、0.12 mg/mL、0.16 mg/mL和0.20 mg/mL的兒茶素標準品溶液。分別移取上述不同濃度的溶液0.5 mL置于10 mL比色管中，然后依次加入2.5 mL的30 g/L香草醛-甲醇溶液和2.5 mL的30%硫酸-甲醇溶液，在30 ℃水浴里避光反應15 min，在波長(cháng)500 nm處測定吸光值，以?xún)翰杷貪舛葹闄M坐標，吸光值為縱坐標，繪制兒茶素的標準曲線(xiàn)[2]。

(2)蓮房原花青素提取率的計算。取1.3.1和1.3.2項制備的樣品，按照(1)項操作。用70%乙醇作為待測液，在相同條件下，作一組空白對照試驗。利用兒茶素標準曲線(xiàn)的回歸方程計算提取液中原花青素的質(zhì)量濃度，然后計算蓮房原花青素的提取率。

式中：n 為提取液稀釋倍數;c 為提取液中原花青素的質(zhì)量濃度，mg/mL;V 為提取液體積，mL;m為蓮房樣品質(zhì)量g。

在單因素試驗基礎上，選用乙醇體積分數(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)和提取次數(D)4 個(gè)因素，以 LSPC 提取率(X)、LSOPC 提取率(Y)、LSPPC提取率(Z)為指標，采用 L9(34)正交試驗設計優(yōu)化提取工藝。

1.3.5 單因素實(shí)驗

原花青素結構中含有多個(gè)酚羥基，易溶于水、甲醇、乙醇和稀酸等極性溶劑中 [3-4]，因此選擇酒精溶液作為蓮房原花青素的提取劑，采用超聲波輔助進(jìn)行提取，以 LSPC 提取率(X)、LSOPC 提取率(Y)、LSPPC 提取率(Z)為考察指標，分別考察乙醇體積分數(40%、50%、60%、70% 和 80%)、料液比(1︰10、1︰15、1︰20、1︰25和 1︰30)、提取時(shí)間(10 min、15 min、20 min、25 min和30 min)、提取次數(1次、2 次、3 次、4 次和 5 次)等因素對蓮房原花青素提取效果的影響。按照 1.3.1 和 1.3.2 項制備樣品，然后按照(1)項操作，最后按照 1.3.3 中(2)分別計算提取率。

1.3.6 正交試驗設計優(yōu)化提取工藝

在單因素試驗基礎上，確定提取工藝影響因素水平。選用乙醇體積分數(A)、料液比(B)、提取時(shí)間(C)和提取次數(D)4 個(gè)因素，以 LSPC 提取率 % (X)、LSOPC 提取率 %(Y)、LSPPC 提取率 %(Z)為指標，采用 L9(34)正交試驗設計優(yōu)化提取工藝。按照多指標權重分析進(jìn)行綜合總評分，并進(jìn)行直觀(guān)分析與方差分析。

1.4 AHP法確定指標權重

1.4.1 建立優(yōu)先矩陣

為了優(yōu)化蓮房原花青素的抗氧化活性部位提取工藝，將LSPC提取率(%)、LSOPC提取率(%)、LSPPC提取率(%)作為權重指標予以量化，即將3個(gè)指標分為3個(gè)層次，并確定各指標的優(yōu)先順序為：LSOPC提取率%()>LSPC提取率%()>LSPPC提取率%()，構建成對比較的優(yōu)先判斷矩陣，同時(shí)賦予各指標相對評分，見(jiàn)表1。

1.4.2 歸一化權重系數

1.4.3 一致性比率

CR=CI/RI，作為衡量所得權重系數是否合理的指標，經(jīng)計算一致性比例因子 CR=0.008 9，CR < 0.10即指標比較的優(yōu)先判斷矩陣具有滿(mǎn)意的一致性，所得權重系數有效。

2 結果與分析

2.1 兒茶素標準曲線(xiàn)

采用1.3.1的方法，繪制出兒茶素的標準曲線(xiàn)如圖1所示。

2.2 蓮房原花青素提取工藝優(yōu)化的單因素試驗結果

2.2.1 不同因素對蓮房原花青素(LSPC)提取的影響

以蓮房原花青素(LSPC)的提取率(%)為評價(jià)指標，采用單因素實(shí)驗方法考察乙醇體積分數(%)、料液比(g/mL)、提取時(shí)間(min)、提取次數(次)4個(gè)不同因素對評價(jià)指標的影響，得到結果如圖2所示。研究結果顯示，乙醇體積分數在60%，料液比1︰20，提取時(shí)間25 min時(shí)蓮房原花青素(LSPC)的提取率較高，提取次數(3次和4次)差別不明顯，從實(shí)際操作角度考慮，選擇采用提取4次作為單因素試驗優(yōu)化結果。

2.2.2 不同因素對蓮房原花青素(LSOPC)提取的影響

以蓮房原花青素(LSOPC)的提取率(%)為評價(jià)指標，采用單因素實(shí)驗方法考察乙醇體積分數(%)、料液比(g/mL)、提取時(shí)間(min)、提取次數(次)4個(gè)不同因素對評價(jià)指標的影響，得到結果如圖3所示。研究結果顯示，乙醇體積分數在60%，料液比1︰20，提取時(shí)間20 min時(shí)蓮房原花青素(LSOPC)的提取率較高，提取次數(3次、4次、5次)差別不明顯，從實(shí)際操作角度考慮，選擇采用提取4次作為單因素試驗優(yōu)化結果。

2.2.3 不同因素對蓮房原花青素(LSPPC)提取的影響

以蓮房原花青素(LSPPC)的提取率(%)為評價(jià)指標，采用單因素實(shí)驗方法考察乙醇體積分數(%)、料液比(g/mL)、提取時(shí)間(min)、提取次數/(次)4個(gè)不同因素對評價(jià)指標的影響，得到結果如圖4所示。研究結果顯示，乙醇體積分數在60%，料液比1︰15，提取時(shí)間20 min，提取3次時(shí)蓮房原花青素(LSPPC)的提取率較高。

2.3 正交優(yōu)化實(shí)驗結果

根據2.2項的單因素試驗結果，最終確定提取工藝影響因素水平，見(jiàn)表2。

按照正交試驗 L9(34)進(jìn)行試驗，分別計算實(shí)驗結果 X、Y 和 Z 值，以 1.4.2 確認的權重分別計算出 9 組正交試驗綜合評分(M)，總得分(M)=0.539 6Y+0.297 0X+ 0.163 4Z，結果見(jiàn)表 3。

以綜合評分為標準，對表 3 中數據直觀(guān)分析表明(表 4)，優(yōu)化提取工藝為 A1B2C3D2，方差分析結果(表 5)顯示因素 A、B、C、D 對實(shí)驗結果均無(wú)顯著(zhù)影響，最終確認生產(chǎn)工藝為 A1B2C3D2，即加入 50% 乙醇，料液比 1 ︰ 15，超聲提取 4 次，每次 30 min。

2.4 驗證試驗

取蓮房樣品適量，按照優(yōu)化提取工藝進(jìn)行驗證試驗，分別測定LSPC、LSOPC和LSPPC提取率，結果見(jiàn)表6。所得工藝簡(jiǎn)便、穩定、可行。

3 結論與討論

超聲的機械作用和空化作用可以破壞細胞壁，加強細胞內有效成分的傳遞作用，且不會(huì )改變小分子化學(xué)成分的結構與性質(zhì)，可以加快細胞內代謝產(chǎn)物的溶出速度[5]。因此，較一般常規溶劑加熱提取方式提取時(shí)間更短，提取效率更高。

層次分析法(The Analytic Hierarchy Process，簡(jiǎn)稱(chēng)AHP法)是一種解決多目標的復雜問(wèn)題的定性與定量相結合的決策分析方法，判斷和衡量目標能否實(shí)現的標準之間的相對重要程度，并合理地給出每個(gè)決策方案的各標準的權數，利用權數求出各方案的優(yōu)劣次序[6-7]。

本實(shí)驗綜合考慮蓮房中總原花青素(LSPC)、低聚蓮房原花青素(LSOPC)、高聚蓮房原花青素(LSPPC)提取率，以乙醇體積分數、料液比、提取時(shí)間和提取次數為考察因素，采用層次分析法、多指標加權綜合分析法，利用正交設計優(yōu)選原花青素的提取效率。優(yōu)化后的工藝具有良好的重現性、穩定性和可操作性。