張　楊

(廣元市產(chǎn)品質(zhì)量監督檢驗所，四川廣元 628000)

摘　要:目的：為使各微生物實(shí)驗室達到比較一致的檢驗質(zhì)量和質(zhì)控水平，發(fā)現食品安全抽檢工作中存在的問(wèn)題，提高檢驗結果的準確度和可信性，參加2020年度由四川省市場(chǎng)監督管理局組織的盲樣考核工作。方法：依據《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數》(GB 4789.3—2016)第二法大腸菌群平板計數法對盲樣進(jìn)行大腸菌群定量分析。結果：該盲樣的大腸菌群數為4.0×104 CFU/mL，結果評價(jià)為滿(mǎn)意。結論：此次盲樣考核對微生物檢驗能力和檢驗過(guò)程各個(gè)環(huán)節質(zhì)量控制的提高有重要作用。

關(guān)鍵詞：盲樣考核;大腸菌群;質(zhì)量控制

大腸菌群是世界上大多數國家和組織評價(jià)食品衛生質(zhì)量的重要安全性指標之一，因和腸道致病菌有密切的相關(guān)性，大腸菌群在食品微生物指標體系中占有重要地位，被稱(chēng)為糞便污染指示菌[1]。2020年度四川省市場(chǎng)監督管理局組織開(kāi)展食品安全監督專(zhuān)項抽檢，其中28批次大腸菌群不符合食品安全國家標準，主要不合格產(chǎn)品為瓶裝飲用水、糕點(diǎn)、調味品、餐具等。大腸菌群超標反映出食品企業(yè)衛生狀況不達標，可能與加工原料受污染、產(chǎn)品的滅菌不徹底、衛生操作規范執行不嚴格、包裝材料受污染等原因有關(guān)[2]。食品微生物實(shí)驗室的常規檢驗項目包含大腸菌群檢驗，是絕大部分食品都會(huì )要求檢驗的項目。檢驗大腸菌群方法有很多種，本次盲樣考核要求采用平板計數法，適用于大腸菌群含量較高的食品。

1　材料與方法

1.1　盲樣來(lái)源和保存

由中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價(jià)中心下發(fā)玻璃瓶包裝的凍干塊狀樣品，樣品到達實(shí)驗室后，按盲樣考核作業(yè)指導書(shū)要求立即放入-15 ℃以下的冰箱中保存。

1.2　培養基試劑和儀器設備

本次盲樣考核中使用的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(以下簡(jiǎn)稱(chēng)VRBA)、煌綠乳糖膽鹽肉湯(以下簡(jiǎn)稱(chēng)BGLB)均由青島海博生物技術(shù)有限公司提供，并進(jìn)行性能試驗且在有限期內，符合使用要求。

生化培養箱、電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、生物安全柜等。

1.3　方法

按照《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數》(GB 4789.3—2016)第二法大腸菌群平板計數法進(jìn)行檢驗[3]。

1.3.1　樣品制備

需要用總計40 mL滅菌生理鹽水再水化，即本次凍干的樣品等同于40 mL的食品樣品。首先從冰箱中取出盲樣使其達到室溫后，將西林瓶無(wú)菌開(kāi)啟，立即加入4 mL滅菌生理鹽水進(jìn)行再水化，凍干塊狀樣品溶解后，放入準備的無(wú)菌錐型瓶中，再反復用余下的生理鹽水清洗西林瓶?jì)缺?，回收清洗液放入上述無(wú)菌錐型瓶中，此溶液為待測樣品原液[4]。

1.3.2　樣品稀釋

用無(wú)菌吸管吸取25 mL待測樣品原液，放入盛有225 mL無(wú)菌生理鹽水中振搖，充分混勻，制成1︰10的樣品勻液。用1 mL無(wú)菌吸管吸取1︰10樣品勻液1 mL注入9 mL無(wú)菌生理鹽水試管中，混合均勻，制成1︰100的樣品勻液，按上述操作以此類(lèi)推稀釋至1︰10 000。每稀釋一次，換一根無(wú)菌吸管。

2　結果與分析

2.1　平板計數

吸取1︰10～1︰10 000稀釋度樣品勻液1 mL于無(wú)菌平皿中，每個(gè)稀釋度做2個(gè)無(wú)菌平皿，同時(shí)取1 mL無(wú)菌生理鹽水加入無(wú)菌平皿中作空白對照。將平皿中倒入融化并恒溫46 ℃的VRBA瓊脂15～20 mL，并小心轉動(dòng)平皿，混合均勻，待瓊脂凝固后，再加入3～4 ml VRBA覆蓋平板表層，翻轉后置于(36±1)℃培養24 h。結果見(jiàn)表1。

2.2　菌落的選擇和證實(shí)試驗

經(jīng)培養后，VRBA平板上均出現0.5～3 mm紫紅色周?chē)屑t色膽鹽沉淀環(huán)的菌落。由表1可知，只有1︰1 000稀釋度的菌落數在計數范圍之內，從1:1 000稀釋度的兩個(gè)VRBA平板上挑取10個(gè)不同類(lèi)型的典型和可疑菌落分別接種到BGLB肉湯管中，(36±1)℃培養48 h后10支BGLB肉湯管均出現產(chǎn)氣現象。

2.3　大腸菌群平板計數的報告

該盲樣的大腸菌群數為：

40×10/10×103 mL=4.0×104 CFU/mL。

2.4　項目結果評價(jià)

本次食品中大腸菌群(定量)檢測項目盲樣考核結果評價(jià)為滿(mǎn)意。

3　結論與討論

(1)參加考核前，要認真閱讀盲樣考核作業(yè)指導書(shū)，按其要求對待測樣品進(jìn)行前處理。由于食品中微生物的數量和種類(lèi)會(huì )隨著(zhù)環(huán)境的改變而出現消長(cháng)，故食品微生物盲樣樣品很少提供食品實(shí)物，多數為人工模擬樣品的凍干粉形式出現。對于定量項目來(lái)說(shuō)凍干塊的樣品為一個(gè)樣品單元，它是一個(gè)不可分割的整體，不能僅用一部分來(lái)檢驗，其次樣品的均勻性也會(huì )對檢驗結果造成直接影響，因此要在無(wú)菌條件下將樣品充分混勻后隨機取樣。

在日常檢驗工作中首先需根據產(chǎn)品選擇適當的檢測方法，若食品中大腸菌群含量較低，可選擇半定量計數MPN法，而大腸菌群較多的食品則可以選擇定量計數平板法[5]。其次，要選擇合適的稀釋度，稀釋度越高，檢驗人員的工作量越大，稀釋度選擇太低，平板上的菌落數又多不可計算?！妒称钒踩珖覙藴?食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數》(GB 4789.3—2016)中要求選擇2～3個(gè)適宜的連續稀釋度，但作為盲樣考核，為了保證數據的準確性，需要根據實(shí)際情況多選擇幾個(gè)稀釋度，同時(shí)檢驗過(guò)程中盡量選取雙人雙平行同步檢驗，減少人員誤差。

(2)培養基對目標微生物檢出的準確性起重要作用，使用培養基時(shí)應嚴格按照《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 培養基和試劑的質(zhì)量要求》(GB 4789.28—2013)進(jìn)行制備和驗證。結晶紫中性紅膽鹽瓊脂作為選擇性培養基是不需要進(jìn)行滅菌的，煮沸2 min即可使用，該培養基需現配現用，不得超過(guò)3 h。在檢驗過(guò)程中，為防止有遷徙性細菌生長(cháng)蔓延，對觀(guān)察結果造成影響，必須待第一次傾注的VRBA凝固后，再將其覆蓋一層，其目的是隔絕空氣，降低需氧菌生長(cháng)速度。

為了提高大腸菌群的檢出率這就要求平時(shí)要多觀(guān)察VRBA平板上大腸菌群的不同形態(tài)，并挑取菌落進(jìn)行BGLB肉湯管證實(shí)試驗，這樣才能對大腸菌群的各種形態(tài)了然于心，防止檢驗工作中錯檢漏檢。

(3)驗證試驗時(shí)，為了降低檢驗過(guò)程中的誤差，挑取菌落時(shí)需注意典型菌落和可疑菌落的比例?！妒称钒踩珖覙藴?食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數》(GB 4789.3—2016)要求選取菌落數在15～150 CFU的平板，挑取10個(gè)不同類(lèi)型典型和可疑菌落，少于10個(gè)菌落的挑取全部典型和可疑菌落進(jìn)行BGLB發(fā)酵驗證試驗，但是并未說(shuō)明每個(gè)平板挑取10個(gè)還是兩個(gè)平板總共挑取10個(gè)。如果平板上菌落形態(tài)單一，則兩個(gè)平板總共挑取10個(gè)進(jìn)行驗證，若平板上菌落形態(tài)差異較大，則最好是每個(gè)平板上挑取10個(gè)菌落進(jìn)行驗證，并且對典型和可疑菌落按照比例挑取驗證，最終計算結果時(shí)，還需要分別計算典型菌落的陽(yáng)性率和可疑菌落的陽(yáng)性率。

提高實(shí)驗室質(zhì)量控制是為了確保檢驗工作的準確性，為產(chǎn)品質(zhì)量評價(jià)提供可靠的依據。積極參加盲樣考核和能力驗證活動(dòng)，是對實(shí)驗室技術(shù)能力和管理狀況進(jìn)行考核的方法之一，也是保證實(shí)驗室資質(zhì)質(zhì)量的重要手段，對實(shí)驗室質(zhì)量控制十分重要。

參考文獻

[1]雷蘭蘭.食品微生物能力驗證的重要因素[J].現代食品,2018(12):4-6.

[2]唐軼君,張建軍,李晶,等.水中銅綠假單胞菌盲樣考核結果與分析[J].生物化工,2017(3):46-49

[3]中華人民共和國國家衛生和技術(shù)生育委員會(huì ).食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數:GB 4789.3—2016[S].北京:中國標準出版社,2016.

[4]辛雙陽(yáng),董慶林,何天文.淺析食品中大腸菌群檢測能力驗證的質(zhì)量控制[J].食品安全導刊,2021(15):72.

[5]郭軍明,孫煥芝,侯秀珍,等.對VRBA大腸菌群平板計數法的試驗改進(jìn)及研究[J].農業(yè)技術(shù)與裝備,2021(5):28-29.